Wie Gelelektrophorese funktioniert: ein DNA-Gel lesen und Banden am Marker bestimmen

Was die DNA antreibt

Jedes Nukleotid der DNA trägt an seinem Phosphat eine negative Ladung, daher wandert DNA im elektrischen Feld zur positiven Elektrode (der roten; merke: „zum Roten laufen“). In freier Lösung wachsen Ladung und Reibung gleichmäßig mit der Länge, ein Fragment von 100 bp und eines von 10.000 bp wären also gleich schnell. Erst das Gel trennt sie: Agarose erstarrt zu einem Netz aus Poren, und längere Moleküle werden auf ihrem Weg hindurch stärker zurückgehalten.

Was bestimmt, wo eine Bande landet

Fragmentlänge. Im nutzbaren Bereich eines Gels fällt die Laufstrecke ungefähr linear mit dem Logarithmus der Länge. Eine Verdopplung der Größe setzt eine Bande überall in diesem Bereich um etwa dieselbe Strecke zurück.
Agarosekonzentration. Ein dichteres Gel hat kleinere Poren. Grob: 0,7 % für 5 bis 20 kb, 1 % für 0,5 bis 10 kb, 1,5 % für 0,2 bis 3 kb, 2 bis 3 % für 50 bp bis 1 kb.
Feldstärke. Die Geschwindigkeit ist proportional zur Spannung pro Zentimeter zwischen den Elektroden, nicht zur Spannung selbst. 5 bis 8 V/cm sind üblich; ein Minigel in einer Kammer mit 15 cm Elektrodenabstand läuft mit etwa 100 V.
Form. Superspiralisiertes Plasmid ist kompakt und läuft linearer DNA gleicher Länge voraus; eingekerbtes Plasmid (offener Ring) schleppt sich und läuft hinterher; RNA und Einzelstränge falten sich und laufen unvorhersehbar.
Puffer und Farbstoff. TAE trennt große Fragmente etwas besser, TBE kleine. Ethidiumbromid bremst DNA leicht, und Ladefarbstoffe laufen mit Fragmenten einer Größe, die vom Gel abhängt: Bromphenolblau mit etwa 300 bis 500 bp in 1 % Agarose, Xylencyanol mit etwa 3 bis 4 kb.

Eine Bandengröße am Marker bestimmen

Ein Marker ist eine Mischung von Fragmenten bekannter Größe, die in einer eigenen Spur läuft. Miss die Strecke von der Tasche zu jeder Markerbande, trage log₁₀(Größe) gegen die Strecke auf und lege eine Gerade hindurch: die Standardkurve. Lies daran die Größe einer unbekannten Bande ab.

Rechenbeispiel: In einem 1-%-Gel ist die 3.000-bp-Markerbande 2,6 cm gelaufen und die 1.000-bp-Bande 4,0 cm. Die Gerade durch beide hat die Steigung (log₁₀ 1.000 − log₁₀ 3.000) ÷ (4,0 − 2,6) = −0,477 ÷ 1,4 = −0,341 pro cm. Eine unbekannte Bande bei 3,3 cm liegt bei log₁₀(Größe) = log₁₀ 3.000 − 0,341 × 0,7 = 3,477 − 0,239 = 3,238, ihre Größe ist also 10^3,238 ≈ 1.730 bp. Nimm die beiden Markerbanden links und rechts der unbekannten oder eine Gerade durch mehrere, und lies nicht über die letzte Markerbande hinaus ab.

Typische Ergebnisse lesen

Ungeschnittenes Plasmid: zwei oder drei Banden, superspiralisiert ganz unten, eingekerbt ganz oben, manchmal linear dazwischen. Keine davon liegt an einem linearen Marker bei der wahren Plasmidgröße.
Linearisiertes Plasmid (ein Schnitt): eine Bande bei der vollen Länge, eine gute Probe, dass ein einzelnes Enzym geschnitten hat.
Doppelverdau: Fragmente, die zusammen die Plasmidgröße ergeben sollten. Tun sie es nicht, ist vielleicht ein kleines Fragment herausgelaufen oder zu schwach, oder zwei ähnlich große Fragmente liegen in einer Bande.
PCR-Produkt: eine scharfe Bande bei der erwarteten Größe. Ein Schmier bedeutet zu viel Matrize oder zu viele Zyklen; zusätzliche Banden, dass Primer an falschen Stellen binden; eine unscharfe Bande ganz unten, Primerdimere.

Die Simulation benutzen

Im Gelelektrophorese-Simulator enthalten die Spuren 1 bis 6 einen Marker, ein ungeschnittenes Plasmid, das einmal und zweimal geschnittene Plasmid, ein PCR-Produkt und Größen, die du eintippst. Der Lauf startet sofort. Stoppe, wenn die Bromphenolblau-Front etwa drei Viertel des Wegs zurückgelegt hat, und lies dann die Größen unter dem Bild ab, jede geschätzt aus einer Geraden durch die Markerbanden, die noch auf dem Gel sind. Zum Ausprobieren:

Setze Spur 6 auf 100, 150, 200 und lass ein 1-%-Gel laufen: Die drei laufen dicht beieinander, knapp vor der Farbstofffront. Wiederhole es mit 2,5 %, und sie trennen sich.
Setze Spur 6 auf 20000, 30000, 48000 in 1 % Agarose: Sie sammeln sich in einer Bande, der Grenzmobilität.
Dreh die Spannung auf 250 V: Der Lauf ist schnell, aber die Banden verschwimmen, und die mittleren Spuren laufen den Rändern voraus (Lächeln), weil das Gel heiß wird.
Lass den Lauf weiterlaufen: Die kleinen Fragmente und der Farbstoff laufen hinten heraus und sind verloren.

Was das Modell annimmt

Eine empirische Mobilitätsformel, μ = μ₀ ÷ (1 + (L ÷ L*)^0,9) mit L* = 2.000 bp × (1 % ÷ T)^1,4, so gewählt, dass sie für 0,5 bis 3 % Agarose in TAE realistische Positionen ergibt. Sie ist eine Anpassung, keine Theorie darüber, wie DNA durch Poren wandert, und ihre Zahlen sind typisch, nicht exakt für eine bestimmte Agarosemarke.
Eine Grenzmobilität für sehr lange DNA, unter die kein Fragment langsamer wird; in 1 % Agarose wird sie bei etwa 20 kb erreicht.
Feste Formfaktoren für Plasmide: Superspiralisierte DNA läuft wie lineare DNA mit dem 0,6-Fachen ihrer Länge, eingekerbte wie mit dem 1,8-Fachen. In Wirklichkeit ändern sich die Faktoren mit Gelkonzentration, Spannung, Grad der Superspiralisierung und damit, ob Ethidiumbromid im Gel ist.
Gleiche Stoffmengen jedes Fragments in einem Verdau (äquimolar), sodass die Helligkeit einer Bande proportional zur Länge ist, und 300 ng DNA pro Probenspur. Eine Bande braucht etwa 2 ng, um sichtbar zu sein.
Ein gleichmäßiges Feld und eine gleichmäßige Temperatur im ganzen Gel, 15 cm zwischen den Elektroden und ein Pufferwiderstand von 1,6 kΩ, abgesehen von einem einfachen Wärmeabzug über 10 V/cm.
Bandenbreite aus Diffusion plus Taschenbreite; Überladung, Salz in der Probe und ungleichmäßige Taschen, die echte Banden verformen, fehlen.

Grenzfälle

Fragmente außerhalb des Markers bekommen ein Fragezeichen: Die Gerade wird über ihre Daten hinaus verlängert und kann weit danebenliegen.
Zwei fast gleich große Fragmente laufen als eine Bande, doppelt so hell. Nur die Helligkeit verrät es; ein längerer Lauf oder ein dichteres Gel kann sie trennen.
Sehr kleine Fragmente (unter etwa 100 bp in 1 % Agarose) laufen mit der Farbstofffront und werden von ihr verdeckt, und sehr schwache Banden unter etwa 2 ng erscheinen nie.
Ein Fragment, das länger als das Plasmid ist, ist in einem Doppelverdau unmöglich; ist der Schnittabstand größer eingestellt, als das Plasmid erlaubt, begrenzt die Simulation ihn.
Über das Ende hinaus laufen: Kurz nachdem der Farbstoff das Gel verlassen hat, stoppt der Lauf, und Banden, die hinausgelaufen sind, lassen sich nicht bestimmen.

Wo das Modell nicht mehr stimmt

Über etwa 20 bis 50 kb bewegt sich DNA durch Reptation, schlangenartig mit einem Ende voran, und alle langen Fragmente laufen zusammen. Sie zu trennen braucht Pulsfeld-Gelelektrophorese, die das Modell nicht beschreiben kann.
Polyacrylamidgele trennen Fragmente, die sich um eine einzige Base unterscheiden, wie bei der Sequenzierung; Agarose kann das nicht, und die Formel gilt für sie nicht.
Proteine werden in SDS-PAGE-Gelen getrennt, nach einem anderen Mechanismus (SDS überzieht sie mit einer längenproportionalen Ladung); dafür gibt es den SDS-PAGE-Gel-Rechner.
Einzelsträngige DNA und RNA falten sich zu Formen, die ihre Geschwindigkeit ändern; sie brauchen denaturierende Gele, um nach Größe zu laufen.
Echte Gele sind nicht gleichmäßig: ungleichmäßige Erwärmung, ein schiefes Gel, Salz oder zu viel DNA in einer Spur biegen und verschmieren Banden auf eine Weise, die man beim Lesen erkennen lernt und die ein Modell nicht zeigt.

Rechner

Gieß das Gel mit dem Agarosegel-Rechner (und der Anleitung Ein Agarosegel gießen), bestimme Banden aus deinen eigenen Messungen mit Bandengröße im Gel schätzen und sag die Fragmente eines Verdaus mit der Restriktionskarte voraus.

Wie Gelelektrophorese funktioniert und wie man ein DNA-Gel liest