Gelelektrophorese-Simulator
Gleichungen in dieser Simulation
| V | Spannung V (Volt) | DNA ist negativ geladen und wandert daher von der schwarzen Elektrode (−) zur roten (+) | |
|---|---|---|---|
| d | Abstand zwischen den Elektroden | 15 cm in dieser Kammer; entscheidend ist die Feldstärke E, eine längere Kammer braucht also mehr Volt | |
| E | elektrische Feldstärke | etwa 5 bis 8 V/cm für einen normalen Lauf | |
| v | Geschwindigkeit einer Bande | in cm pro Stunde |
Mit den aktuellen Werten:
| μ₀ | Mobilität der DNA in freier Lösung | 3 × 10⁻⁴ cm²/(V·s), für jede Länge gleich, weil Ladung und Reibung beide mit der Länge wachsen | |
|---|---|---|---|
| L | Länge des Fragments (bp) | das Gel ist ein Sieb: lange Fragmente werden stärker zurückgehalten | |
| T | Agarose T (% w/v) | ein dichteres Gel hat kleinere Poren und trennt kleine Fragmente besser, große schlechter | |
| L* | die Länge, bei der das Gel auf halbe Geschwindigkeit bremst | eine empirische Anpassung; über etwa 20 kb läuft in einem 1-%-Gel jedes Fragment mit derselben Grenzgeschwindigkeit, und sie sammeln sich in einer Bande |
Mit den aktuellen Werten:
| a, b | die Standardkurve | eine Gerade, an die Markerbanden angepasst; eine unbekannte Bande daran abgelesen ergibt ihre Größe | |
|---|---|---|---|
| R² | wie gut die Gerade passt | sie sinkt, wenn Markerbanden nahe oben oder unten den Bereich verlassen, den das Gel gut trennt |
Mit den aktuellen Werten:
| σ | Breite einer Bande | die Bande beginnt so breit wie die Tasche und verbreitert sich durch Diffusion; ein langer, langsamer Lauf gibt unschärfere Banden, und Joulesche Wärme über etwa 10 V/cm verschmiert sie zusätzlich |
|---|
Mit den aktuellen Werten:
| R | Widerstand des Puffers | etwa 1,6 kΩ für ein Minigel in 1× TAE | |
|---|---|---|---|
| P | Heizleistung | erwärmt Gel und Puffer: zu viel, und das Gel lächelt (die mittleren Spuren laufen vor) oder schmilzt |
Mit den aktuellen Werten:
So benutzt du den Gelelektrophorese-Simulator
- Spur 1 enthält einen Marker bekannter Größen, Spur 2 ein ungeschnittenes Plasmid, Spur 3 das einmal geschnittene Plasmid, Spur 4 das mit zwei Enzymen geschnittene Plasmid, Spur 5 ein PCR-Produkt und Spur 6 beliebige Größen, die du eintippst. Das Gel läuft sofort los: Die DNA wandert von der schwarzen Elektrode zur roten, die blauen Ladefarbstoffe laufen voraus.
- Achte auf Laufzeit und Farbstofffront und stoppe, wenn das Bromphenolblau etwa drei Viertel des Wegs zurückgelegt hat, bevor kleine Fragmente hinten herauslaufen. Ändere die Agarosekonzentration: Ein dichtes Gel trennt kleine Fragmente, ein dünnes große. Dreh die Spannung hoch, um schneller zu laufen, und sieh, wie die Banden über etwa 10 V/cm verschmieren und lächeln, weil das Gel heiß wird.
- Lies die Bandengrößen unter dem Bild ab: Die Simulation passt eine Gerade aus log Größe gegen Laufstrecke an die Markerbanden an und liest jede andere Bande daran ab, mit einem Fragezeichen, wo eine Bande außerhalb des Markers liegt. Das Diagramm zeigt diese Standardkurve. Zum Gießen des Gels nimm den Agarosegel-Rechner, zum Bestimmen von Banden aus einem echten Gel das Tool Bandengröße im Gel schätzen.
Häufige Fragen
Warum wandert DNA durch das Gel?
Ihr Phosphatrückgrat trägt pro Base eine negative Ladung, daher wandert DNA im elektrischen Feld zur positiven Elektrode. Ladung und Reibung wachsen in freier Lösung beide mit der Länge, alle Fragmente wären also gleich schnell; erst das Agarosenetz trennt sie, weil es lange Moleküle stärker zurückhält als kurze.
Warum gibt ungeschnittenes Plasmid mehr als eine Bande?
Ein Plasmid frisch aus der Zelle ist überwiegend superspiralisiert, eng in sich verdreht; das macht es kompakt, und es läuft linearer DNA gleicher Länge voraus. Plasmide mit einem Bruch in einem Strang entspannen sich zu einem offenen Ring, der sich durch das Gel schleppt und hinterherläuft. Einmal geschnitten wird das Plasmid zu einer einzigen linearen Bande bei seiner wahren Länge.
Welche Agarosekonzentration soll ich nehmen?
Etwa 0,7 % für Fragmente von 5 bis 20 kb, 1 % für 0,5 bis 10 kb, 1,5 % für 0,2 bis 3 kb und 2 bis 3 % für 50 bp bis 1 kb. Kleine Fragmente laufen in einem dünnen Gel zusammen, und in einem dichten Gel kommen große kaum hinein. Über etwa 20 kb wandern in einem gewöhnlichen Gel alle Fragmente mit derselben Grenzgeschwindigkeit und sammeln sich in einer Bande; für sie gibt es die Pulsfeld-Gelelektrophorese.
Wie genau ist das Ablesen einer Bandengröße am Marker?
Auf etwa 5 bis 10 % genau, wenn die Bande in der Mitte des Gels zwischen Markerbanden liegt, wo log Größe fast linear mit der Laufstrecke fällt. Nahe am oberen und unteren Rand und außerhalb des Markerbereichs wird es ungenauer, und superspiralisiertes oder eingekerbtes Plasmid lässt sich an einem linearen Marker gar nicht bestimmen.
Es heißt, WebGL sei abgeschaltet.
Die 3D-Ansicht braucht WebGL, das jeder aktuelle Browser hat. Es kann abgeschaltet sein, wenn die Hardwarebeschleunigung in den Browsereinstellungen deaktiviert ist oder der Grafiktreiber sehr alt ist. Schalte die Hardwarebeschleunigung ein oder probier einen anderen Browser.
Wird etwas hochgeladen?
Nein. Die Simulation zeichnet dein eigener Browser mit WebGL; nichts wird irgendwohin gesendet, und sie läuft auch offline weiter, sobald die Seite geladen ist.