PCR-Simulator
Gleichungen in dieser Simulation
| N₀ | Anfangskopien der Matrize (als Zehnerpotenz) | doppelsträngige Kopien zu Beginn | |
|---|---|---|---|
| E | Effizienz E (Anteil der Matrizen, die pro Zyklus kopiert werden), % | 90 bis 100 % in einer guten Reaktion; hier gesenkt, wenn T_a zu nah an der Tm der Primer liegt und wenn der Reaktion Primer und Nukleotide ausgehen | |
| n | Zyklusnummer | jeder Zyklus: denaturieren bei 95 °C, anlagern bei T_a, verlängern bei 72 °C | |
| N_n | doppelsträngige Kopien nach n Zyklen | flacht bei etwa 10¹² Kopien ab: das Plateau |
Mit den aktuellen Werten:
| Zielkopien | Produkte genau in der Länge des Amplikons | die ersten entstehen in Zyklus 3; bis dahin laufen die neuen Stränge über die Primerstellen hinaus (lange Produkte), und deren Zahl wächst nur um 2 pro Zyklus, darum ist das Ziel bald in der Überzahl | |
|---|---|---|---|
| lange Produkte | Kopien mit einem Strang, der länger als das Amplikon ist | entstehen aus Strängen, die über eine Primerstelle hinauslaufen; die Zahlen unter dem Bild verfolgen jede Art von Molekül genau |
Mit den aktuellen Werten:
| Tm | Schmelztemperatur jedes Primers | die einfache Formel für Primer ab 14 Basen; der Primer-Tm-Rechner hat den genaueren Nächste-Nachbarn-Wert | |
|---|---|---|---|
| T_a | Annealing-Temperatur T_a (°C) | meist 3 bis 5 °C unter dem niedrigeren Tm; viel höher und die Primer bleiben nicht gebunden, viel niedriger und sie binden an falschen Stellen | |
| f_b | Anteil der Primer, die sich anlagern | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1,5)), eine einfache Schmelzkurve für den Primer |
Mit den aktuellen Werten:
| L | Amplikonlänge | in Basenpaaren, Primer eingeschlossen |
|---|
Mit den aktuellen Werten:
So benutzt du den PCR-Simulator
- Füge eine Matrize und zwei Primer ein, beide 5′ nach 3′ geschrieben: den Vorwärtsprimer so, wie er in der Matrize steht, den Rückwärtsprimer so, wie er auf dem anderen Strang steht. Der Simulator findet, wo sie binden, die Amplikonlänge und die Tm jedes Primers; prüf ein Primerpaar genauer mit dem Primer-Tm-Rechner.
- Verfolge jeden Zyklus in der Nahaufnahme: bei 95 °C gehen die beiden Stränge auseinander, bei der Annealing-Temperatur lagern sich die Primer an ihren Stellen an, und bei 72 °C verlängert die Polymerase von jedem einen neuen Strang. Darunter füllt sich das Röhrchen mit Kopien: graue mit einem Originalstrang, blaue lange Produkte, die über die Primerstellen hinauslaufen, grüne Ziel-Amplikons genau der richtigen Länge.
- Stell Annealing-Temperatur, Effizienz und Zahl der Anfangskopien ein und lies nach jedem Zyklus die genaue Zahl jeder Produktart ab. Das Diagramm zeigt die Kopien logarithmisch, wo die Vervielfältigung eine Gerade ist, die ins Plateau abknickt. Wie viele Kopien eine bestimmte DNA-Masse sind, rechnet der DNA-Kopienzahl-Rechner aus, mit seiner Anleitung.
Häufige Fragen
Wie viele Kopien macht eine PCR?
Jeder Zyklus kann die DNA höchstens verdoppeln, n Zyklen ergeben also bis zu 2ⁿ Kopien pro Matrize: etwa eine Milliarde nach 30 Zyklen. Echte Reaktionen laufen mit 90 bis 100 % Effizienz, N = N₀ (1 + E)ⁿ, und flachen bei etwa 10¹² Kopien ab, wenn Primer und Nukleotide ausgehen.
Warum sind die ersten Produkte länger als das Ziel?
Im ersten Zyklus kopiert jeder Primer den Originalstrang von seiner Stelle bis zum Ende der Matrize, weil nichts der Polymerase sagt, wann sie aufhören soll. Erst wenn ein Primer an einen dieser neuen Stränge bindet, der an der Stelle des anderen Primers endet, entsteht ein Strang genau der Ziellänge. Die ersten doppelsträngigen Zielmoleküle erscheinen in Zyklus 3, und nach 30 Zyklen machen sie fast alle Produkte aus: 2ⁿ − 2n pro Matrize, gegenüber 2n langen Produkten.
Wie wähle ich die Annealing-Temperatur?
Fang 3 bis 5 °C unter der niedrigeren Tm der beiden Primer an. Zu heiß, und die Primer bleiben nicht gebunden, sodass die Effizienz einbricht, was der Simulator zeigt; zu kalt, und sie binden auch an teilweise passenden Stellen, was zusätzliche Banden im Gel ergibt. Eine Gradienten-PCR über mehrere Temperaturen findet die beste.
Was ist der Ct-Wert in der qPCR?
In der quantitativen PCR meldet ein Fluoreszenzfarbstoff die DNA, während sie entsteht, und Ct ist der Zyklus, bei dem das Signal eine festgelegte Schwelle kreuzt, wie die gestrichelte Linie im Diagramm. Jede zehnfach größere Ausgangsmenge kreuzt etwa 3,3 Zyklen früher, so misst die qPCR, wie viel da war. Der ΔΔCt-Rechner macht aus Ct-Werten Fold Changes.
Es heißt, WebGL sei abgeschaltet.
Die 3D-Ansicht braucht WebGL, das jeder aktuelle Browser hat. Es kann abgeschaltet sein, wenn die Hardwarebeschleunigung in den Browsereinstellungen deaktiviert ist oder der Grafiktreiber sehr alt ist. Schalte die Hardwarebeschleunigung ein oder probier einen anderen Browser.
Wird etwas hochgeladen?
Nein. Die Simulation zeichnet dein eigener Browser mit WebGL; nichts wird irgendwohin gesendet, und sie läuft auch offline weiter, sobald die Seite geladen ist.