Simulateur de PCR
Équations de cette simulation
| N₀ | Copies initiales de la matrice (en puissance de 10) | copies double brin au départ | |
|---|---|---|---|
| E | Efficacité E (part des matrices copiées à chaque cycle), % | 90 à 100 % dans une bonne réaction ; abaissée ici quand T_a est trop proche du Tm des amorces, et quand la réaction manque d'amorces et de nucléotides | |
| n | numéro du cycle | chaque cycle : dénaturer à 95 °C, hybrider à T_a, allonger à 72 °C | |
| N_n | copies double brin après n cycles | plafonne vers 10¹² copies : le plateau |
Avec les valeurs actuelles :
| copies cibles | produits de la longueur exacte de l'amplicon | les premières apparaissent au cycle 3 ; jusque-là, les nouveaux brins dépassent les sites des amorces (produits longs), et leur nombre ne croît que de 2 par cycle, si bien que la cible les dépasse vite | |
|---|---|---|---|
| produits longs | copies avec un brin plus long que l'amplicon | issus de brins qui dépassent le site d'une amorce ; les comptes sous l'image suivent exactement chaque sorte de molécule |
Avec les valeurs actuelles :
| Tm | température de fusion de chaque amorce | la formule de base pour les amorces de 14 bases ou plus ; le Calculateur de Tm d'amorces donne la valeur plus précise des plus proches voisins | |
|---|---|---|---|
| T_a | Température d'hybridation T_a (°C) | en général 3 à 5 °C sous la plus basse des Tm ; bien plus haut, les amorces ne restent pas fixées, bien plus bas, elles se fixent aux mauvais endroits | |
| f_b | part des amorces qui s'hybrident | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1,5)), une courbe de fusion simple pour l'amorce |
Avec les valeurs actuelles :
| L | longueur de l'amplicon | en paires de bases, amorces comprises |
|---|
Avec les valeurs actuelles :
Comment utiliser le simulateur de PCR
- Collez une matrice et deux amorces, toutes deux écrites de 5′ à 3′ : l’amorce sens telle qu’elle apparaît dans la matrice, l’amorce antisens telle qu’elle apparaît sur l’autre brin. Le simulateur trouve où elles se fixent, la longueur de l’amplicon et le Tm de chaque amorce ; vérifiez un couple d’amorces plus en détail avec le Calcul du Tm d’amorces.
- Suivez chaque cycle en gros plan : à 95 °C les deux brins se séparent, à la température d’hybridation les amorces se fixent à leurs sites, et à 72 °C la polymérase allonge un nouveau brin à partir de chacune. Dessous, le tube se remplit de copies : en gris celles qui ont un brin d’origine, en bleu les produits longs qui dépassent les sites des amorces, en vert les amplicons cibles de la longueur exacte.
- Réglez la température d’hybridation, l’efficacité et le nombre de copies de départ, et lisez après chaque cycle le compte exact de chaque sorte de produit. Le graphique montre les copies en échelle logarithmique, où l’amplification est une droite qui s’infléchit vers le plateau. Pour savoir combien de copies représente une masse d’ADN donnée, utilisez le Calcul du nombre de copies d’ADN et son guide.
Questions fréquentes
Combien de copies une PCR fait-elle ?
Chaque cycle peut au plus doubler l’ADN, donc n cycles donnent jusqu’à 2ⁿ copies par matrice : environ un milliard après 30 cycles. Les vraies réactions tournent à 90 à 100 % d’efficacité, N = N₀ (1 + E)ⁿ, et plafonnent vers 10¹² copies quand les amorces et les nucléotides s’épuisent.
Pourquoi les premiers produits sont-ils plus longs que la cible ?
Au premier cycle, chaque amorce copie le brin d’origine depuis son site jusqu’au bout de la matrice, car rien ne dit à la polymérase de s’arrêter. Ce n’est que lorsqu’une amorce se fixe sur l’un de ces nouveaux brins, qui se termine au site de l’autre amorce, qu’un brin de la longueur exacte de la cible est fabriqué. Les premières molécules cibles double brin apparaissent au cycle 3, et après 30 cycles elles forment presque tous les produits : 2ⁿ − 2n par matrice, contre 2n produits longs.
Comment choisir la température d’hybridation ?
Commencez 3 à 5 °C sous le plus bas des Tm des deux amorces. Trop chaud, les amorces ne restent pas fixées et l’efficacité s’effondre, ce que montre le simulateur ; trop froid, elles se fixent aussi à des endroits qui ne correspondent qu’en partie, ce qui donne des bandes en trop sur le gel. Une PCR en gradient sur plusieurs températures trouve la meilleure.
Qu’est-ce que le Ct en qPCR ?
En PCR quantitative, un colorant fluorescent signale l’ADN au fur et à mesure qu’il est fabriqué, et le Ct est le cycle où le signal franchit un seuil fixé, comme la ligne pointillée du graphique. Chaque matrice dix fois plus abondante le franchit environ 3,3 cycles plus tôt, et c’est ainsi que la qPCR mesure la quantité de départ. Le Calcul ΔΔCt convertit les Ct en variations d’expression.
Il est indiqué que WebGL est désactivé.
La vue 3D a besoin de WebGL, présent dans tous les navigateurs actuels. Il peut être désactivé si l'accélération matérielle est coupée dans les réglages du navigateur, ou à cause d'un pilote graphique très ancien. Activez l'accélération matérielle ou essayez un autre navigateur.
Quelque chose est-il envoyé ?
Non. La simulation est dessinée par votre propre navigateur avec WebGL ; rien n'est envoyé nulle part, et elle continue de fonctionner hors ligne une fois la page chargée.