Simulador de PCR
Ecuaciones de esta simulación
| N₀ | Copias iniciales del molde (como potencia de 10) | copias de doble hebra al principio | |
|---|---|---|---|
| E | Eficiencia E (fracción de moldes copiados en cada ciclo), % | 90 a 100 % en una buena reacción; aquí baja cuando T_a está demasiado cerca de la Tm de los cebadores y cuando a la reacción se le acaban los cebadores y los nucleótidos | |
| n | número de ciclo | cada ciclo: desnaturalizar a 95 °C, hibridar a T_a, extender a 72 °C | |
| N_n | copias de doble hebra tras n ciclos | se estabiliza cerca de 10¹² copias: la meseta |
Con los valores actuales:
| copias diana | productos con la longitud exacta del amplicón | las primeras aparecen en el ciclo 3; hasta entonces las hebras nuevas pasan más allá de los sitios de los cebadores (productos largos), y su número solo crece 2 por ciclo, así que la diana pronto los supera | |
|---|---|---|---|
| productos largos | copias con una hebra más larga que el amplicón | salen de hebras que pasan más allá del sitio de un cebador; los recuentos bajo la imagen siguen cada tipo de molécula con exactitud |
Con los valores actuales:
| Tm | temperatura de fusión de cada cebador | la fórmula básica para cebadores de 14 bases o más; la Calculadora de Tm de cebadores tiene el valor más preciso de vecinos más cercanos | |
|---|---|---|---|
| T_a | Temperatura de hibridación T_a (°C) | normalmente 3 a 5 °C por debajo de la Tm más baja; mucho más alta y los cebadores no se quedan unidos, mucho más baja y se unen en sitios equivocados | |
| f_b | fracción de cebadores que hibridan | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1,5)), una curva de fusión sencilla para el cebador |
Con los valores actuales:
| L | longitud del amplicón | en pares de bases, cebadores incluidos |
|---|
Con los valores actuales:
Cómo usar el simulador de PCR
- Pega un molde y dos cebadores, ambos escritos de 5′ a 3′: el cebador directo tal como aparece en el molde y el inverso tal como aparece en la otra hebra. El simulador encuentra dónde se unen, la longitud del amplicón y la Tm de cada cebador; revisa una pareja de cebadores con más detalle en la Calculadora de Tm de cebadores.
- Sigue cada ciclo en el primer plano: a 95 °C las dos hebras se separan, a la temperatura de hibridación los cebadores se unen en sus sitios y a 72 °C la polimerasa extiende una hebra nueva desde cada uno. Debajo, el tubo se llena de copias: grises las que tienen una hebra original, azules los productos largos que pasan de los sitios de los cebadores, verdes los amplicones diana de la longitud justa.
- Ajusta la temperatura de hibridación, la eficiencia y el número de copias iniciales, y lee tras cada ciclo la cuenta exacta de cada tipo de producto. La gráfica muestra las copias en escala logarítmica, donde la amplificación es una recta que se curva hacia la meseta. Para saber cuántas copias son una masa dada de ADN, usa la Calculadora de número de copias de ADN y su guía.
Preguntas frecuentes
¿Cuántas copias hace una PCR?
Cada ciclo puede como mucho duplicar el ADN, así que n ciclos dan hasta 2ⁿ copias por molde: unos mil millones tras 30 ciclos. Las reacciones reales van al 90 a 100 % de eficiencia, N = N₀ (1 + E)ⁿ, y se estabilizan cerca de 10¹² copias cuando se acaban los cebadores y los nucleótidos.
¿Por qué los primeros productos son más largos que la diana?
En el primer ciclo cada cebador copia la hebra original desde su sitio hasta el final del molde, porque nada le dice a la polimerasa que pare. Solo cuando un cebador se une a una de esas hebras nuevas, que termina en el sitio del otro cebador, se hace una hebra de la longitud exacta de la diana. Las primeras moléculas diana de doble hebra aparecen en el ciclo 3, y tras 30 ciclos son casi todos los productos: 2ⁿ − 2n por molde, frente a 2n productos largos.
¿Cómo elijo la temperatura de hibridación?
Empieza 3 a 5 °C por debajo de la Tm más baja de los dos cebadores. Demasiado caliente y los cebadores no se quedan unidos, así que la eficiencia se hunde, como muestra el simulador; demasiado fría y se unen también a sitios que encajan a medias, lo que da bandas de más en el gel. Una PCR en gradiente a varias temperaturas encuentra la mejor.
¿Qué es el Ct en qPCR?
En la PCR cuantitativa un colorante fluorescente informa del ADN a medida que se hace, y el Ct es el ciclo en que la señal cruza un umbral fijado, como la línea discontinua de la gráfica. Cada molde diez veces mayor lo cruza unos 3,3 ciclos antes, que es como la qPCR mide cuánto había. La Calculadora ΔΔCt convierte los valores de Ct en cambios de expresión.
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