Qué hace bueno a un cebador
- Longitud: de 18 a 30 bases.
- Contenido en GC: del 40 al 60%.
- Temperatura de fusión: aproximadamente de 55 a 65 °C, con los dos cebadores de la pareja a menos de unos 5 °C entre sí.
- Extremo 3′: terminar en G o C, la pinza GC, pero sin más de 3 G o C en las últimas 5 bases.
- Evitar: repeticiones de la misma base, tramos que se emparejan con el propio cebador (horquillas y dímeros de cebador) y tramos que se emparejan con el otro cebador.
Temperatura de fusión
La fórmula más sencilla cuenta 2 °C por cada A o T y 4 °C por cada G o C, y solo es razonable para cebadores cortos. Los cebadores más largos se estiman mejor con fórmulas basadas en el GC, con corrección por sales, o mejor aún con el método de vecinos más cercanos, que mira cada par de bases vecinas y tiene en cuenta las concentraciones de cebador y de sodio.
Comprobar tus cebadores
- Pega tus cebadores, uno por línea, en Análisis de cebadores PCR.
- Indica las concentraciones de cebador y de sodio de tu reacción.
- Compara los valores de Tm y lee los avisos sobre horquillas, autodímeros, repeticiones o el extremo 3′.
Comprobar el producto
Productos de PCR encuentra dónde se unen los cebadores directo y reverso a un molde y da el tamaño y la secuencia de cada producto, así que un sitio de unión de más aparece antes de correr un gel. Mapa de cebadores dibuja un conjunto de cebadores sobre la secuencia con flechas que indican su sentido.
Comprobar un cebador
Toma 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′. Tiene 23 bases, 10 de ellas G o C, así que el contenido en GC es 10 ÷ 23 = 43 %, dentro del rango del 40 al 60 %. Termina en GG, una pinza GC, con tres G o C en las últimas cinco bases, el máximo habitual. La regla simple 2 + 4 da 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C, que sobrestima en un cebador de esta longitud. Un cálculo de vecinos más próximos con tus condiciones de sal es más fiable.
Temperatura de hibridación
Un punto de partida habitual es unos 3 a 5 °C por debajo de la Tm más baja de la pareja. Si tienes dudas, haz una PCR en gradiente con varias temperaturas y elige la que dé una sola banda limpia.
Añadir un sitio de restricción
Para clonar el producto, añade el sitio de la enzima al extremo 5′ del cebador, con 4 a 6 bases extra delante para que la enzima pueda cortar cerca del extremo. Calcula la Tm solo con la parte que se une al molde, porque la cola no se une en los primeros ciclos.
Problemas frecuentes
- No hay producto. Baja la temperatura de hibridación, compara las secuencias de los cebadores con el molde y confirma que el molde está presente.
- Varias bandas. Sube la temperatura de hibridación y busca otros lugares donde puedan unirse los cebadores.
- Una banda débil por debajo de 100 pb. Suele ser un dímero de cebadores, los cebadores unidos entre sí. Rediséñalos para evitar extremos 3′ complementarios o baja su concentración.