Qué hace bueno a un cebador
- Longitud: de 18 a 30 bases.
- Contenido en GC: del 40 al 60%.
- Temperatura de fusión: aproximadamente de 55 a 65 °C, con los dos cebadores de la pareja a menos de unos 5 °C entre sí.
- Extremo 3′: terminar en G o C, la pinza GC, pero sin más de 3 G o C en las últimas 5 bases.
- Evitar: repeticiones de la misma base, tramos que se emparejan con el propio cebador (horquillas y dímeros de cebador) y tramos que se emparejan con el otro cebador.
Temperatura de fusión
La fórmula más sencilla cuenta 2 °C por cada A o T y 4 °C por cada G o C, y solo es razonable para cebadores cortos. Los cebadores más largos se estiman mejor con fórmulas basadas en el GC, con corrección por sales, o mejor aún con el método de vecinos más cercanos, que mira cada par de bases vecinas y tiene en cuenta las concentraciones de cebador y de sodio.
Comprobar tus cebadores
- Pega tus cebadores, uno por línea, en Análisis de cebadores PCR.
- Indica las concentraciones de cebador y de sodio de tu reacción.
- Compara los valores de Tm y lee los avisos sobre horquillas, autodímeros, repeticiones o el extremo 3′.
Comprobar el producto
Productos de PCR encuentra dónde se unen los cebadores directo y reverso a un molde y da el tamaño y la secuencia de cada producto, así que un sitio de unión de más aparece antes de correr un gel. Mapa de cebadores dibuja un conjunto de cebadores sobre la secuencia con flechas que indican su sentido.