একটি প্রাইমারকে ভালো করে যা
- দৈর্ঘ্য: 18 থেকে 30 বেস।
- GC-র পরিমাণ: 40 থেকে 60%।
- গলনের তাপমাত্রা: মোটামুটি 55 থেকে 65 °C, আর একটি জোড়ার দুটি প্রাইমার একে অন্যের প্রায় 5 °C-এর ভেতরে।
- 3′ প্রান্ত: একটি G বা C-তে শেষ করুন, অর্থাৎ GC খিল, তবে শেষ 5 বেসে 3-র বেশি G বা C নয়।
- এড়িয়ে চলুন: একই বেসের একটানা টান, যে টান প্রাইমারটির নিজের সঙ্গে জোড়া বাঁধে (হেয়ারপিন আর প্রাইমার ডাইমার), আর যে টান অন্য প্রাইমারের সঙ্গে জোড়া বাঁধে।
গলনের তাপমাত্রা
সবচেয়ে সরল সূত্রটি প্রতিটি A বা T-র জন্য 2 °C আর প্রতিটি G বা C-র জন্য 4 °C গোনে, আর তা কেবল ছোট প্রাইমারের জন্যই মানানসই। লম্বা প্রাইমারের আন্দাজ ভালো হয় GC-ভিত্তিক সূত্রে, লবণের শোধন সহ, আর সবচেয়ে ভালো হয় নিকটতম-প্রতিবেশী উপায়ে, যা পাশাপাশি বসা প্রতিটি বেস-জোড়া দেখে আর প্রাইমার ও সোডিয়ামের ঘনত্ব হিসাবে নেয়।
আপনার প্রাইমার পরখ করুন
- আপনার প্রাইমারগুলো, প্রতি লাইনে একটি, PCR প্রাইমারের পরিসংখ্যান-এ সেঁটে দিন।
- আপনার বিক্রিয়ার প্রাইমার আর সোডিয়ামের ঘনত্ব বসান।
- Tm-র মানগুলো মিলিয়ে দেখুন আর হেয়ারপিন, স্ব-ডাইমার, একটানা টান কিংবা 3′ প্রান্ত নিয়ে কোনো সতর্কতা থাকলে পড়ে নিন।
উৎপাদটি পরখ করুন
PCR উৎপাদ খুঁজে দেখে সামনের আর উল্টো প্রাইমার একটি টেমপ্লেটের কোথায় জুড়ে বসে, আর প্রতিটি উৎপাদের মাপ ও ধারা দেয়, তাই একটি বাড়তি জোড়ার জায়গা একটি জেল চালানোর আগেই ধরা পড়ে। প্রাইমারের ম্যাপ একগুচ্ছ প্রাইমার ধারার ওপরে এঁকে দেয়, তাদের দিক দেখানো তিরসহ।
একটি প্রাইমার দেখে নেওয়া
5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′ নিন। তা 23 বেস লম্বা, আর তাতে 10টি G বা C, তাই GC-র পরিমাণ 10 ÷ 23 = 43%, অর্থাৎ 40 থেকে 60% পরিসরের ভেতরে। তা GG-তে শেষ হয়, অর্থাৎ একটি GC খিল, আর শেষ পাঁচ বেসে তিনটি G বা C, যা চলতি সবচেয়ে বেশি। সরল 2 + 4 নিয়ম দেয় 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C, যা এতটা লম্বা একটি প্রাইমারে বাড়িয়ে দেখায়। আপনার লবণের অবস্থা নিয়ে একটি নিকটতম-প্রতিবেশীর হিসাব আরও ভরসার যোগ্য।
জোড়া বাঁধার তাপমাত্রা
একটি চেনা শুরুর বিন্দু হলো জোড়ার কম Tm-র প্রায় 3 থেকে 5 °C নিচে। নিশ্চিত না হলে কয়েকটি তাপমাত্রা জুড়ে একটি গ্রেডিয়েন্ট PCR চালিয়ে যেটি একটিই পরিষ্কার ব্যান্ড দেয় তা বেছে নিন।
একটি রেস্ট্রিকশনের জায়গা জোড়া
উৎপাদটি ক্লোন করতে প্রাইমারের 5′ প্রান্তে এনজাইমটির জায়গা জুড়ে দিন, আর তার আগে 4 থেকে 6 বাড়তি বেস, যাতে এনজাইমটি প্রান্তের কাছে কাটতে পারে। Tm কেবল সেই অংশটি ধরেই বের করুন যা টেমপ্লেটে জোড়া বাঁধে, কারণ ল্যাজটি গোড়ার চক্রে জোড়াই বাঁধে না।
চেনা সমস্যা
- কোনো উৎপাদ নেই। জোড়া বাঁধার তাপমাত্রা নামিয়ে দিন, প্রাইমারের ধারা টেমপ্লেটের বিপরীতে দেখে নিন, আর টেমপ্লেটটি আদৌ আছে কি না তা নিশ্চিত করুন।
- কয়েকটি ব্যান্ড। জোড়া বাঁধার তাপমাত্রা বাড়িয়ে দিন, আর প্রাইমার আর কোথায় জোড়া বাঁধতে পারত তা খুঁজে দেখুন।
- 100 bp-র নিচে একটি হালকা ব্যান্ড। তা সাধারণত প্রাইমার ডাইমার, অর্থাৎ প্রাইমারগুলো একে অন্যের সঙ্গে জোড়া লেগে গেছে। পূরক 3′ প্রান্ত এড়াতে আবার নকশা করুন, কিংবা প্রাইমারের ঘনত্ব নামিয়ে দিন।