রেস্ট্রিকশন এনজাইম কাটে কীভাবে
প্রতিটি এনজাইম একটি ছোট ধারা চেনে, প্রায়ই 4 থেকে 8 বেসের একটি প্যালিনড্রোম, আর তার ভেতরে বা পাশে কাটে। EcoRI চেনে GAATTC আর দুটি সূত্রকেই G আর A-র মাঝে কাটে, রেখে যায় চার-বেসের AATT ঝুল, যাকে বলে আঠালো প্রান্ত। EcoRV GATATC-কে একেবারে মাঝখান দিয়ে কাটে, রেখে যায় ভোঁতা প্রান্ত।
কোন এনজাইম কাটে তা খুঁজুন
- ধারাটি রেস্ট্রিকশনের সারসংক্ষেপ-এ সেঁটে দিন।
- সরলরেখা না বৃত্তাকার তা বেছে নিন। একটি প্লাজমিড বৃত্তাকার।
- এনজাইমের তালিকা, কাটার সংখ্যা, জায়গা আর টুকরোর মাপ পড়ে নিন।
যে এনজাইমগুলো একবার কাটে, একটি প্লাজমিড খুলতে সেগুলোই ব্যবহার করার। একটি বৃত্তে n-টি কাটায় n-টি টুকরো হয়; একটি সরলরেখার অণুতে হয় n + 1।
ধারার ওপরে জায়গাগুলো দেখুন
রেস্ট্রিকশন ম্যাপ ধারাটি ছাপে, ওপরে প্রতিটি কাটার জায়গা দাগানো, যা আপনার ভাবা জায়গাতেই একটি জায়গা বসেছে কি না তা মিলিয়ে নেওয়া, কিংবা একটি জিনের দুপাশে দুটি এনজাইম খুঁজে নেওয়া সহজ করে দেয়।
প্রোটিন না বদলে একটি জায়গা বানান
হাতের কাছে কোনো জায়গা না থাকলে এক বা দুটি নীরব মিউটেশন কখনো একটি বানিয়ে দিতে পারে, আর প্রোটিনটি একই থাকে। কাটার জন্য মিউটেট করুন একটি সংকেতী ধারায় ওই জায়গাগুলোর তালিকা দেয়, যা জায়গা-নির্দিষ্ট মিউটাজেনেসিসে কিংবা একটি প্রাইমারে ঢুকিয়ে দেওয়ার জন্য তৈরি।
টুকরোগুলো আগেভাগে বলে দেওয়া
400 অবস্থানে একটি EcoRI জায়গা আর 1,300-তে একটি BamHI জায়গাওয়ালা একটি 4,000 bp প্লাজমিড নিন।
- বৃত্তাকার, দুটি দিয়েই কাটা: 1,300 − 400 = 900 bp আর 4,000 − 900 = 3,100 bp।
- বৃত্তাকার, কেবল EcoRI দিয়ে কাটা: একটি কাটা বৃত্তটি খুলে একটিই 4,000 bp ব্যান্ড বানায়।
- একই ধারা একটি সরলরেখার অণু হিসেবে, দুটি দিয়েই কাটা: 400, 900 আর 2,700 bp।
না-কাটা প্লাজমিড একটি জেলে তার আসল মাপে চলে না: অতিকুণ্ডলিত DNA সাধারণত সরলরেখার রূপটির চেয়ে দ্রুত চলে, তাই সবসময়ই একটি কাটা নমুনার সঙ্গে মিলিয়ে দেখুন।
চেনা সমস্যা
- একটি জায়গা আছে কিন্তু এনজাইম কাটছে না। চেনা E. coli ধারার DNA-তে Dam আর Dcm মিথাইল বসিয়ে দেয়, যা একটি জায়গা একটি মিথাইল-বসা ধারার ওপরে পড়লে কিছু এনজাইম আটকে দেয়। XbaI আর ClaI প্রায়ই এর শিকার। সেগুলো দরকার হলে প্লাজমিডটি একটি dam− dcm− ধারায় বাড়িয়ে নিন।
- বাড়তি ব্যান্ড দেখা দিচ্ছে। বেশি এনজাইম, একটি লম্বা সময় কিংবা বিক্রিয়ায় 5%-র বেশি গ্লিসারল কিছু এনজাইমকে একই রকম ধারাতেও কাটিয়ে দিতে পারে, যাকে বলে তারা-ক্রিয়া। এনজাইমের আয়তন বিক্রিয়ার এক-দশমাংশ কিংবা তার কমই রাখুন।
- একটি PCR উৎপাদের একেবারে প্রান্তের একটি জায়গা কাটছে না। অনেক এনজাইমের জোড়া বাঁধতে জায়গাটি পেরিয়ে কয়েকটি বাড়তি বেস দরকার। প্রাইমারে জায়গাটির আগে 4 থেকে 6 বেস জুড়ে দিন।
- দুটি এনজাইমের আলাদা বাফার দরকার। সরবরাহকারীর জোড়া-কাটার ছকটি দেখে নিন, কিংবা একটি এনজাইম দিয়ে কেটে DNA সাফ করে তারপর অন্যটি দিয়ে কাটুন।