একটি গাইডে যা দরকার
চলতি SpCas9-র জন্য গাইডটি হলো 20 বেস, যা লক্ষ্য DNA-র সঙ্গে মেলে, আর লক্ষ্যটির ঠিক পরেই একই সূত্রকে একটি NGG PAM থাকতে হবে। Cas9 কাটে PAM-র 3 বেস আগে। PAM নিজে গাইডের অংশ নয়।
জায়গা যেকোনো সূত্রকেই থাকতে পারে: নিচের সূত্রকের একটি NGG ওপরে CCN হিসেবে দেখা দেয়।
জায়গাগুলোর মধ্যে বাছা
- অবস্থান। একটি জিন নক আউট করতে সব ট্রান্সক্রিপ্টে ভাগ করা একটি আগের এক্সনকে লক্ষ্য করুন, যাতে ফ্রেমশিফট প্রোটিনটি ঘেঁটে দেয়। একটি নিখুঁত বদলের জন্য কাটাটি বদলের প্রায় 10 বেসের ভেতরে হওয়া উচিত।
- 40 থেকে 80% GC-র পরিমাণ। খুব কম GC দুর্বলভাবে জোড়া বাঁধে; খুব বেশি GC অন্য কোথাও বেশি সহজেই জোড়া বেঁধে ফেলতে পারে।
- TTTT নয়। একটানা চারটি T বেশির ভাগ গাইড প্লাজমিডে ব্যবহার করা U6 প্রবর্তক থেকে ট্রান্সক্রিপশন থামিয়ে দেয়।
- শুরুতে একটি G U6 ট্রান্সক্রিপশনে সাহায্য করে; না থাকলে অনেক পদ্ধতিই একটি জুড়ে দেয়।
লক্ষ্য-ছাড়া জায়গা
একটি গাইড এমন জায়গাও কাটতে পারে যা কয়েকটি বেসে আলাদা, বিশেষ করে যখন অমিলগুলো PAM থেকে দূরে। ফরমাশ দেওয়ার আগে আপনার ছোট তালিকার গাইডগুলো একটি জিনোম-জুড়ে খোঁজার সরঞ্জাম দিয়ে পুরো জিনোমের বিপরীতে পরখ করুন, আর যেগুলোর অন্য কোথাও কাছাকাছি মিল নেই সেগুলোই বাছুন।
সম্ভাব্য জায়গা খুঁজুন
আপনার লক্ষ্য ধারাটি CRISPR গাইড খুঁজুন-এ সেঁটে দিন। তা দুটি সূত্রকেরই প্রতিটি জায়গা তার অবস্থান, সূত্রক আর GC-র পরিমাণসহ সাজিয়ে দেয়, NGG আর অন্য PAM-র জন্যও। কাটার চারপাশে একটি ছাঁকনির কাটা সাজাতে রেস্ট্রিকশন ম্যাপ ব্যবহার করুন।
একটি জায়গা কষে দেখানো
নিচের ধারাটিতে যেকোনো একটি সূত্রকে একটি কাজে লাগার জায়গা আছে, অর্থাৎ তার সামনে পুরো 20 বেসওয়ালা একটি NGG:
ATGGCTAGCAAGGAGT TCATCCGTGACCTGAAGTTC TGG TAA- গাইড: TCATCCGTGACCTGAAGTTC, 17 থেকে 36 বেস।
- PAM: TGG, 37 থেকে 39 বেস।
- GC-র পরিমাণ: 20 বেসের মধ্যে 10, অর্থাৎ 50%।
- কাটা: 33 আর 34 বেসের মাঝে, PAM-র তিন বেস আগে।
ক্লোনিংয়ের জন্য অলিগো ফরমাশ দেওয়া
অনেক Cas9 প্লাজমিড গাইডটি এমন দুটি জোড়া-বাঁধানো অলিগো হিসেবে নেয়, যাদের ঝুল কাটা ভেক্টরের সঙ্গে মেলে। গাইডটি T দিয়ে শুরু হয়, তাই U6 প্রবর্তকের জন্য একটি G জুড়ে দেওয়া হয়:
সামনের: 5′-CACCG TCATCCGTGACCTGAAGTTC-3′
উল্টো: 5′-AAAC GAACTTCAGGTCACGGATGA C-3′উল্টো অলিগোটি গাইডটির উল্টো পূরক, আর তার 3′ প্রান্তের C জোড়া বাঁধে জুড়ে দেওয়া G-র সঙ্গে।
চেনা সমস্যা
- কম সম্পাদনা। গাইড কত ভালো কাটে তাতে অনেকটাই হেরফের হয়। প্রতিটি লক্ষ্যের জন্য দুই-তিনটি ফরমাশ দিন আর সবচেয়ে ভালোটি রেখে দিন।
- সম্পাদনা করা কোষ তখনো প্রোটিনটি বানায়। 3, 6 কিংবা 9 বেসের ইনডেল পাঠের ফ্রেম ধরেই রাখে। কয়েকটি ক্লোন দেখে নিন, আর প্রোটিনটির কাজে যে এক্সনে এসে যায় তাতেই একটি গাইড বাছুন।
- সম্পাদনাটি একটি জেলে দেখা যায় না। ছোট ইনডেল ব্যান্ডের মাপ বদলায় না। একটি অমিল কাটার পরখ, PCR উৎপাদের সিকোয়েন্সিং, কিংবা কাটায় ধ্বংস হওয়া একটি রেস্ট্রিকশনের জায়গা নিন।