Yang dibutuhkan pemandu
Untuk SpCas9 yang umum, pemandu adalah 20 basa yang cocok dengan DNA target, dan target harus langsung diikuti PAM NGG pada untai yang sama. Cas9 memotong 3 basa sebelum PAM. PAM sendiri bukan bagian dari pemandu.
Situs bisa ada di untai mana pun: NGG di untai bawah tampak sebagai CCN di untai atas.
Memilih di antara situs
- Posisi. Untuk knockout gen, sasar ekson awal yang dimiliki semua transkrip, agar pergeseran bingkai merusak protein. Untuk penyuntingan presisi, potongan sebaiknya berjarak paling jauh sekitar 10 basa dari perubahan.
- Kandungan GC 40 sampai 80%. GC sangat rendah mengikat lemah; GC sangat tinggi bisa terlalu mudah mengikat di tempat lain.
- Tanpa TTTT. Empat T berurutan menghentikan transkripsi dari promotor U6 yang dipakai kebanyakan plasmid pemandu.
- G di awal membantu transkripsi U6; jika tidak ada, banyak protokol menambahkannya.
Off-target
Pemandu juga bisa memotong situs yang berbeda beberapa basa, terutama jika ketidakcocokannya jauh dari PAM. Sebelum memesan, periksa pemandu pilihan terhadap seluruh genom dengan alat pencarian genom dan pilih yang tidak punya kecocokan dekat di tempat lain.
Temukan situs kandidat
Tempel sekuens target ke Pencari Pemandu CRISPR. Alat ini mencantumkan setiap situs di kedua untai beserta posisi, untai, dan kandungan GC, untuk NGG dan PAM lain. Gunakan Peta Restriksi untuk merencanakan digesti penyaringan di sekitar potongan.