Como as enzimas de restrição cortam
Cada enzima reconhece uma sequência curta, muitas vezes um palíndromo de 4 a 8 bases, e corta dentro dela ou ao lado. A EcoRI reconhece GAATTC e corta entre G e A nas duas fitas, deixando pontas AATT de quatro bases, chamadas extremidades coesivas. A EcoRV corta GATATC bem no meio e deixa extremidades cegas.
Descobrir quais enzimas cortam
- Cole a sequência no Resumo de restrição.
- Escolha linear ou circular. Um plasmídeo é circular.
- Leia a lista de enzimas, o número de cortes, as posições e os tamanhos dos fragmentos.
As enzimas que cortam uma única vez são as que servem para abrir um plasmídeo. Em uma molécula circular, n cortes dão n fragmentos; em uma linear, dão n + 1.
Ver os sítios na sequência
O Mapa de restrição imprime a sequência com cada sítio de corte marcado acima, o que facilita conferir se um sítio está onde você acha ou encontrar duas enzimas dos dois lados de um gene.
Adicionar um sítio sem mudar a proteína
Se não houver um sítio conveniente, uma ou duas mutações silenciosas às vezes criam um sem mudar a proteína. Mutar para digestão lista esses pontos em uma sequência codificadora, prontos para uma mutagênese sítio-dirigida ou para incluir em um primer.