Como as enzimas de restrição cortam
Cada enzima reconhece uma sequência curta, muitas vezes um palíndromo de 4 a 8 bases, e corta dentro dela ou ao lado. A EcoRI reconhece GAATTC e corta entre G e A nas duas fitas, deixando pontas AATT de quatro bases, chamadas extremidades coesivas. A EcoRV corta GATATC bem no meio e deixa extremidades cegas.
Descobrir quais enzimas cortam
- Cole a sequência no Resumo de restrição.
- Escolha linear ou circular. Um plasmídeo é circular.
- Leia a lista de enzimas, o número de cortes, as posições e os tamanhos dos fragmentos.
As enzimas que cortam uma única vez são as que servem para abrir um plasmídeo. Em uma molécula circular, n cortes dão n fragmentos; em uma linear, dão n + 1.
Ver os sítios na sequência
O Mapa de restrição imprime a sequência com cada sítio de corte marcado acima, o que facilita conferir se um sítio está onde você acha ou encontrar duas enzimas dos dois lados de um gene.
Adicionar um sítio sem mudar a proteína
Se não houver um sítio conveniente, uma ou duas mutações silenciosas às vezes criam um sem mudar a proteína. Mutar para digestão lista esses pontos em uma sequência codificadora, prontos para uma mutagênese sítio-dirigida ou para incluir em um primer.
Prevendo os fragmentos
Pegue um plasmídeo de 4.000 pb com um sítio EcoRI na posição 400 e um sítio BamHI na 1.300.
- Circular, cortado com as duas: 1.300 − 400 = 900 pb e 4.000 − 900 = 3.100 pb.
- Circular, cortado só com EcoRI: um corte abre o círculo numa única banda de 4.000 pb.
- A mesma sequência como molécula linear, cortada com as duas: 400, 900 e 2.700 pb.
Plasmídeo não cortado não corre no gel conforme seu tamanho real: o DNA superenovelado costuma correr mais rápido que a forma linear, então compare sempre com uma amostra cortada.
Problemas comuns
- O sítio está lá, mas a enzima não corta. O DNA das linhagens comuns de E. coli é metilado por Dam e Dcm, o que bloqueia algumas enzimas quando o sítio se sobrepõe a uma sequência metilada. XbaI e ClaI costumam ser afetadas. Se precisar delas, propague o plasmídeo numa linhagem dam− dcm−.
- Aparecem bandas extras. Enzima demais, incubação longa ou mais de 5% de glicerol na reação podem fazer algumas enzimas cortarem sequências parecidas, a chamada atividade estrela. Mantenha o volume de enzima em um décimo da reação ou menos.
- Um sítio bem na ponta de um produto de PCR não corta. Muitas enzimas precisam de algumas bases além do sítio para se ligar. Acrescente de 4 a 6 bases antes do sítio no primer.
- Duas enzimas precisam de tampões diferentes. Consulte a tabela de digestão dupla do fornecedor, ou corte com uma enzima, purifique o DNA e depois corte com a outra.