İyi bir primeri ne yapar
- Uzunluk: 18–30 baz.
- GC içeriği: %40–60.
- Erime sıcaklığı: kabaca 55–65 °C; bir çiftin iki primeri birbirinin yaklaşık 5 °C yakınında.
- 3′ ucu: bir G ya da C ile, GC kelepçesiyle bitsin, ama son 5 bazda en fazla 3 G ya da C olsun.
- Kaçın: aynı bazın tekrarlarından, primerin kendisiyle eşleşen bölgelerden (firketeler ve primer dimerleri) ve öbür primerle eşleşen bölgelerden.
Erime sıcaklığı
En basit formül her A ya da T için 2 °C, her G ya da C için 4 °C sayar ve yalnızca kısa primerler için makuldür. Daha uzun primerler GC tabanlı formüllerle, bir tuz düzeltmesiyle ya da en iyisi, her komşu baz çiftine bakan ve primer ile sodyum derişimlerini hesaba katan en yakın komşu yöntemiyle daha iyi tahmin edilir.
Primerlerini kontrol et
- Primerlerini her satıra bir tane olacak şekilde PCR primer istatistikleri aracına yapıştır.
- Tepkimendeki primer ve sodyum derişimlerini ayarla.
- Tm değerlerini karşılaştır ve firketeler, kendi kendine dimerler, tekrarlar ya da 3′ ucu hakkındaki uyarıları oku.
Ürünü kontrol et
PCR ürünleri ileri ve geri primerlerin bir kalıba nereye bağlandığını bulur ve her ürünün boyutunu ve dizisini verir; böylece fazladan bir bağlanma bölgesi sen jel yürütmeden görünür. Primer haritası bir primer takımını yönlerini gösteren oklarla dizi üzerinde çizer.
Tek bir primeri kontrol etmek
5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′’ü al. 23 baz uzunluğundadır ve 10 G ya da C içerir; yani GC içeriği 10 ÷ 23 = %43, %40 ila 60 aralığının içinde. Sonu GG, yani bir GC kıskacıdır ve son beş bazda olağan en fazla değer olan üç G ya da C vardır. Basit 2 + 4 kuralı 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C verir; bu kadar uzun bir primer için bu yüksek çıkar. Kendi tuz koşullarınla yapılan bir komşu baz hesabı daha güvenilirdir.
Bağlanma sıcaklığı
Yaygın bir başlangıç noktası, çiftin düşük Tm’sinin yaklaşık 3 ila 5 °C altıdır. Emin değilsen birkaç sıcaklıkta gradyan PCR çalıştır ve tek bir temiz bant veren sıcaklığı seç.
Kesim bölgesi eklemek
Ürünü klonlamak için enzimin bölgesini primerin 5′ ucuna, enzim uca yakın kesebilsin diye öncesine 4 ila 6 fazladan bazla birlikte ekle. Tm’yi yalnızca kalıba bağlanan kısımdan hesapla, çünkü kuyruk ilk döngülerde bağlanmaz.
Yaygın sorunlar
- Ürün yok. Bağlanma sıcaklığını düşür, primer dizilerini kalıba karşı kontrol et ve kalıbın orada olduğunu doğrula.
- Birkaç bant. Bağlanma sıcaklığını yükselt ve primerlerin bağlanabileceği diğer yerlere bak.
- 100 bp’nin altında soluk bir bant. Bu genellikle primerlerin birbirine bağlanması olan primer dimeridir. Tamamlayıcı 3′ uçlarından kaçınacak şekilde yeniden tasarla ya da primer derişimini düşür.