PCR simülatörü
Bu benzetimdeki denklemler
| N₀ | Kalıbın başlangıç kopyası (10’un kuvveti olarak) | başlangıçtaki çift iplikli kopyalar | |
|---|---|---|---|
| E | Verim E (her döngüde kopyalanan kalıp payı), % | iyi bir tepkimede %90 ile %100; burada T_a primerlerin Tm’sine fazla yakınsa ve tepkime primerleri ile nükleotitleri tükettikçe düşer | |
| n | döngü sayısı | her döngü: 95 °C’de denatürasyon, T_a’da bağlanma, 72 °C’de uzama | |
| N_n | n döngü sonra çift iplikli kopyalar | 10¹² kopya civarında düzleşir: plato |
Mevcut değerlerle:
| hedef kopyalar | tam amplikon uzunluğundaki ürünler | ilkleri 3. döngüde ortaya çıkar; o zamana kadar yeni iplikler primer bölgelerinin ötesine uzar (uzun ürünler) ve sayıları döngü başına yalnızca 2 artar, bu yüzden hedef kısa sürede onları geçer | |
|---|---|---|---|
| uzun ürünler | amplikondan uzun bir ipliği olan kopyalar | bir primer bölgesinin ötesine uzanan ipliklerden oluşur; resmin altındaki sayılar her molekül türünü tam olarak izler |
Mevcut değerlerle:
| Tm | her primerin erime sıcaklığı | 14 baz ve üzeri primerler için temel formül; Primer Tm Hesaplayıcı daha doğru en yakın komşu değerini verir | |
|---|---|---|---|
| T_a | Bağlanma sıcaklığı T_a (°C) | genellikle düşük Tm’nin 3 ile 5 °C altında; çok daha yüksekte primerler bağlı kalmaz, çok daha düşükte yanlış yerlere bağlanır | |
| f_b | bağlanan primerlerin payı | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1,5)), primer için basit bir erime eğrisi |
Mevcut değerlerle:
| L | amplikon uzunluğu | baz çifti olarak, primerler dahil |
|---|
Mevcut değerlerle:
PCR simülatörü nasıl kullanılır
- Bir kalıp ve iki primer yapıştır, ikisi de 5′’ten 3′’e yazılmış olsun: ileri primer kalıpta göründüğü gibi, geri primer öbür zincirde göründüğü gibi. Simülatör nereye bağlandıklarını, amplikon uzunluğunu ve her primerin Tm’sini bulur; bir primer çiftini daha ayrıntılı olarak Primer Tm hesaplayıcı ile kontrol et.
- Her döngüyü yakın planda izle: 95 °C’de iki zincir ayrılır, bağlanma sıcaklığında primerler yerlerine tutunur ve 72 °C’de polimeraz her birinden yeni bir zincir uzatır. Aşağıda tüp kopyalarla dolar: gri özgün kalıplar, primer yerlerinin ötesine uzanan mavi uzun ürünler, tam doğru uzunlukta yeşil hedef amplikonlar.
- Bağlanma sıcaklığını, verimi ve başlangıç kopya sayısını ayarla ve her döngüden sonra her ürün türünün kesin sayısını oku. Grafik kopyaları logaritmik ölçekte çizer; çoğalma orada platoya bükülen düz bir çizgidir. Belirli bir DNA kütlesinin kaç kopya olduğunu hesaplamak için DNA kopya sayısı hesaplayıcıyı ve rehberini kullan.
Sık sorulan sorular
PCR kaç kopya üretir?
Her döngü DNA’yı en fazla iki katına çıkarabilir; yani n döngü kalıp başına 2ⁿ’ye kadar kopya verir: 30 döngüden sonra yaklaşık bir milyar. Gerçek reaksiyonlar %90–100 verimle çalışır, N = N₀ (1 + E)ⁿ, ve primerler ile nükleotitler tükendikçe yaklaşık 10¹² kopyada düzleşir.
İlk ürünler neden hedeften uzun?
İlk döngüde her primer özgün zinciri kendi yerinden kalıbın sonuna kadar kopyalar, çünkü polimeraza durmasını söyleyen bir şey yoktur. Ancak bir primer, öbür primerin yerinde biten bu yeni zincirlerden birine bağlandığında tam hedef uzunluğunda bir zincir yapılır. İlk çift zincirli hedef moleküller 3. döngüde görünür ve 30 döngüden sonra ürünlerin çok küçük bir kısmı dışında hepsini oluştururlar: kalıp başına 2n uzun ürüne karşı 2ⁿ − 2n.
Bağlanma sıcaklığını nasıl seçerim?
İki primerin düşük olan Tm’sinin 3–5 °C altından başla. Çok sıcaksa primerler bağlı kalmaz ve verim çöker, simülatör de bunu gösterir; çok soğuksa kısmen eşleşen yerlere de bağlanırlar ve jelde fazladan bantlar verirler. Birkaç sıcaklıkta yapılan bir gradyan PCR en iyisini bulur.
qPCR’da Ct nedir?
Kantitatif PCR’da floresan bir boya DNA’yı üretildikçe bildirir ve Ct, sinyalin grafikteki kesikli çizgi gibi belirli bir eşiği geçtiği döngüdür. Başlangıç kalıbı her on kat arttığında eşik yaklaşık 3,3 döngü önce geçilir; qPCR başlangıçtaki miktarı böyle ölçer. ΔΔCt hesaplayıcı Ct değerlerini kat değişimlerine çevirir.
WebGL’nin kapalı olduğunu söylüyor.
3B görünüm, güncel her tarayıcıda bulunan WebGL’ye ihtiyaç duyar. Tarayıcı ayarlarında donanım hızlandırma kapatılmışsa ya da grafik sürücüsü çok eskiyse kapalı olabilir. Donanım hızlandırmayı aç ya da başka bir tarayıcı dene.
Bir şey yükleniyor mu?
Hayır. Simülasyonu WebGL ile kendi tarayıcın çizer; hiçbir yere hiçbir şey gönderilmez ve sayfa yüklendikten sonra çevrimdışı da çalışmaya devam eder.