Neye ihtiyacın var
Bir uygulanmış ve bir kontrol örneğinde ölçülmüş, bir hedef gen ve bir referans gen (ifadesi uygulamayla değişmeyen GAPDH ya da ACTB gibi bir temizlik geni) için Ct değerleri.
Üç adım
- Her örneği referans gene göre normalleştir: ΔCt = Ct hedef − Ct referans.
- Uygulanmışı kontrolle karşılaştır: ΔΔCt = ΔCt uygulanmış − ΔCt kontrol.
- Kat değişimine çevir: kat değişimi = 2−ΔΔCt.
Çözümlü bir örnek
Uygulanmış: hedef Ct 22,1, referans Ct 18,0; yani ΔCt = 4,1. Kontrol: hedef Ct 24,5, referans Ct 18,0; yani ΔCt = 6,5.
ΔΔCt = 4,1 − 6,5 = −2,4 ve kat değişimi = 22,4 = 5,3. Hedef, uygulanmış örnekte yaklaşık 5,3 kat daha fazla ifade edilir. 1’in altındaki bir kat değişimi daha düşük ifade demektir; 0,5 yarısıdır.
2^-ΔΔCt ne zaman yetmez
Yöntem iki primer çiftinin de %100’e yakın verimli olduğunu, ürünü her döngüde ikiye katladığını varsayar. Bunu bir standart eğriyle kontrol et; olağan aralık %90–110’dur. Verimler farklıysa her genin kendi verimini hesaba katan Pfaffl yöntemini kullan: oran = EhedefΔCt hedef ÷ EreferansΔCt referans; burada her ΔCt kontrol eksi uygulanmıştır ve E = 1 + verim.
Tekrarlar ve istatistik
- ΔCt’yi hesaplamadan önce teknik tekrarların (aynı örneğin kuyuları) ortalamasını al.
- İstatistiği kat değişimleri üzerinde değil, biyolojik tekrarların ΔCt ya da ΔΔCt değerleri üzerinde yap, çünkü kat değişimi normal dağılmaz.
- Artışı ve azalışı aynı ölçekte istediğinde basitçe −ΔΔCt olan log2 kat değişimini bildir.
Hesaplayıcı
ΔΔCt hesaplayıcı tekrar Ct değerlerinin ortalamasını alır; ΔCt, ΔΔCt, kat değişimi ve log2 kat değişimini verir ve primer verimlerini girdiğinde Pfaffl yöntemine geçer. Standart eğriyle mutlak niceleme için DNA kopya sayısı hesaplayıcı her standarttaki kopyaları hesaplar.