qPCR primerleri nasıl tasarlanır

qPCR primerleri PCR primerlerinden nasıl farklıdır

qPCR bir ürünün döngüden döngüye ne kadar hızlı biriktiğini ölçer; bu yüzden primerlerin hedeflerini %100’e yakın verimle kopyalaması ve yalnızca tek bir ürün yapması gerekir. Bu da doğru banttan herhangi bir miktarın yettiği bir klonlama PCR’ından daha kısa amplikonlar ve daha sıkı kurallar ister. Genel kurallar PCR primerleri nasıl tasarlanır ve kontrol edilir rehberindedir; bunlar qPCR için değişenlerdir.

Kurallar

• Amplikon: yaklaşık 70–150 bp. Kısa bir ürün her döngüde tamamen kopyalanır; bu da verimi yüksek tutar.
• Primer uzunluğu: 18–25 baz.
• Tm: master miksinin tuzu ve magnezyumu için hesaplanmış, yaklaşık 58–62 °C; iki primer birbirinin 1–2 °C yakınında.
• GC içeriği: %40–60; 3′ ucundaki son 5 bazda en fazla 3 G ya da C.
• Kaçın: tek bir bazın, özellikle G’nin 4 ya da daha fazla tekrarından ve primerin kendisiyle ya da öbür primerle eşleşen bölgelerden. Primer dimerleri, dimerler dahil her çift zincirli DNA’yı parlatan SYBR Green ile en çok önem taşır.

Problar

Bir hidroliz (TaqMan) probu iki primerin arasına bağlanır ve primerler uzamaya başladığında zaten bağlı olsun diye onlarınkinden yaklaşık 5–10 °C yüksek bir Tm ile tasarlanır. Raportör boyanın yanındaki 5′ ucunda G’den kaçın, çünkü oradaki bir G floresansı söndürür.

mRNA ölçmek: bir ekzon birleşim yerini kapsa

cDNA’dan gen ifadesi için bir primeri bir ekzon–ekzon birleşim yerinin üzerine yerleştir ya da iki primeri aralarında uzun bir intron olan farklı ekzonlara koy. RNA’da kalan genomik DNA o zaman ya hiç ürün vermez ya da iyi çoğalamayacak kadar uzun bir ürün verir. Ters transkriptaz olmadan tepkimeden geçen RNA olan RT’siz kontrol, genomik DNA’nın hâlâ geçip geçmediğini gösterir.

Primerleri sipariş etmeden önce kontrol et

1. Master miksinin, çoğu zaman 3 mM ya da daha fazla olan magnezyumunu kullanarak iki Tm değerini de Primer Tm hesaplayıcı ile hesapla.
2. Firketeleri, kendi kendine dimerleri ve zayıf ya da yapışkan bir 3′ ucunu PCR primer istatistikleri ile ara.
3. Beklenen boyutta tek bir ürünü doğrulamak için kalıbı PCR ürünleri aracına yapıştır ve başka hedefleri dışlamak için primerleri tüm genoma karşı, örneğin NCBI Primer-BLAST ile ara.

Laboratuvarda kontrol et

Beş ya da daha fazla 10 katlık adımlı bir kalıp seyreltme serisi çalıştır ve Ct’yi miktarın logaritmasına karşı Standart eğri hesaplayıcı ile çiz. Eğim verimi verir: E = 10^−1/eğim − 1. −3,32’lik bir eğim %100 demektir ve %90–110 genellikle kabul edilir. SYBR Green ile tek keskin tepeli bir erime eğrisi tek bir ürünü gösterir ve kalıpsız kontrol düz kalmalıdır. Sonra göreli ifadeyi, iki primer çiftinin verimleri farklı olduğunda Pfaffl yöntemini kullanan ΔΔCt hesaplayıcı ile hesapla.