En qué se diferencian de los cebadores de PCR
Una qPCR mide lo rápido que se acumula el producto, ciclo a ciclo, así que los cebadores tienen que copiar su diana con una eficiencia cercana al 100 % y dar un solo producto. Eso exige amplicones cortos y reglas más estrictas que en una PCR de clonación, donde basta con cualquier cantidad de la banda correcta. Las reglas generales están en Cómo diseñar cebadores de PCR; aquí van las que cambian en qPCR.
Las reglas
- Amplicón: de unos 70 a 150 pb. Un producto corto se copia entero en cada ciclo, lo que mantiene alta la eficiencia.
- Longitud del cebador: de 18 a 25 bases.
- Tm: de unos 58 a 62 °C, con los dos cebadores a menos de 1 o 2 °C entre sí, calculada con las sales y el magnesio de tu master mix.
- Contenido de GC: del 40 % al 60 %, con no más de 3 G o C en las últimas 5 bases del extremo 3′.
- Evita: series de 4 o más bases iguales, sobre todo de G, y tramos que se emparejen con el propio cebador o con el otro. Los dímeros de cebadores importan sobre todo con SYBR Green, que hace brillar cualquier ADN de doble cadena, dímeros incluidos.
Sondas
Una sonda de hidrólisis (TaqMan) se une entre los dos cebadores y se diseña con una Tm de 5 a 10 °C por encima de la de ellos, para que ya esté unida cuando los cebadores empiezan a extenderse. Evita una G en su extremo 5′, junto al fluoróforo, porque una G ahí apaga la fluorescencia.
Para medir ARNm: atraviesa una unión exón-exón
Para la expresión génica a partir de ADNc, coloca un cebador sobre una unión exón-exón, o pon los dos cebadores en exones distintos con un intrón largo entre ellos. Así el ADN genómico que quede en el ARN no da producto, o da uno demasiado largo para amplificarse bien. Un control sin RT, ARN que pasa por la reacción sin transcriptasa inversa, muestra si aún se cuela ADN genómico.
Comprueba los cebadores antes de pedirlos
- Calcula las dos Tm con la calculadora de Tm de cebadores, con el magnesio de tu master mix, que suele ser de 3 mM o más.
- Busca horquillas, autodímeros y un extremo 3′ débil o demasiado pegajoso con PCR Primer Stats.
- Pega el molde en PCR Products para confirmar un único producto del tamaño esperado, y busca los cebadores en todo el genoma, por ejemplo con NCBI Primer-BLAST, para descartar otras dianas.
Compruébalos en el laboratorio
Haz una serie de diluciones del molde, cinco o más pasos de 10 veces, y representa el Ct frente al logaritmo de la cantidad con la calculadora de curva estándar. La pendiente da la eficiencia: E = 10−1/pendiente − 1. Una pendiente de −3,32 significa un 100 %, y del 90 % al 110 % se acepta en general. Con SYBR Green, una curva de fusión con un solo pico definido indica un único producto, y el control sin molde debe quedar plano. Después calcula la expresión relativa con la calculadora de ΔΔCt, que usa el método de Pfaffl cuando las eficiencias de las dos parejas de cebadores difieren.