La densidad de siembra es por superficie
Las células adherentes suelen sembrarse a una densidad en células por cm² de superficie de cultivo, para que la misma densidad dé la misma cobertura en cualquier recipiente. Superficies habituales:
- Placa de 96 pocillos: 0,32 cm² por pocillo
- Placa de 24 pocillos: 1,9 cm² por pocillo
- Placa de 12 pocillos: 3,8 cm² por pocillo
- Placa de 6 pocillos: 9,5 cm² por pocillo
- Frascos T25, T75 y T175: 25, 75 y 175 cm²
Comprueba la ficha del fabricante; las superficies varían un poco entre marcas.
Tres pasos
- Células por recipiente = densidad × superficie. A 20.000 células/cm² en una placa de 6 pocillos: 20.000 × 9,5 = 190.000 células por pocillo.
- Células totales = células por recipiente × número de recipientes, más un 10 % por pérdidas al pipetear. Seis pocillos: 190.000 × 6 × 1,1 = 1.254.000 células.
- Volumen de suspensión = células totales ÷ tu recuento en células/mL. Con 1.000.000 células/mL en la cámara de Neubauer: 1,25 mL, completados con medio hasta el volumen total que necesitas (6 × 2 mL = 12 mL, más un 10 %).
Elegir la densidad
La densidad depende de la línea celular y de cuándo quieras usar las células. Para llegar a una confluencia concreta un día determinado, calcula hacia atrás con el tiempo de duplicación: las células se duplican una vez por tiempo de duplicación cuando se recuperan del pase, normalmente después de un día. Una línea que se duplica cada 24 horas sembrada al 25 % de cobertura está casi confluente en dos o tres días. Las fichas del proveedor y los protocolos publicados dan una densidad inicial para la mayoría de líneas.
Conseguir una capa uniforme
Mezcla la suspensión justo antes de cada transferencia, porque las células se depositan en uno o dos minutos. Después de sembrar, mueve las placas en cruz (adelante-atrás, izquierda-derecha) en vez de en círculos, que empujan las células al borde del pocillo, y déjalas asentarse de 15 a 30 minutos antes de llevarlas a la estufa.
Herramientas
Cuenta las células con la Calculadora de hemocitómetro y luego introduce el recuento y la densidad en la Calculadora de siembra celular para obtener los volúmenes de suspensión y medio para placas y frascos. La Calculadora del tiempo de duplicación lo obtiene a partir de dos recuentos.