Qué significa la Tm
La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la que la mitad del cebador está unida a su diana y la otra mitad está libre. La hibridación de la PCR se fija un poco por debajo, para que los cebadores se unan con firmeza pero solo al sitio correcto.
Tres formas de calcularla
- La regla de Wallace, para cebadores de menos de unas 14 bases: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). Es rápida, pero ignora el orden de las bases y el tampón.
- La fórmula del GC, para cebadores más largos: Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ longitud. Un cebador de 20 bases con 10 G o C da 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 20 = 51,8 °C.
- La termodinámica de vecinos más cercanos, la más precisa: suma la energía de apilamiento de cada par de bases vecinas y corrige según la concentración de cebador y la sal de la reacción.
Por qué importa el tampón
Los cationes neutralizan la carga negativa del esqueleto del ADN, así que más sal significa una Tm más alta. El magnesio tiene un efecto mucho mayor que el sodio, y los dNTP captan parte de él. El mismo cebador puede variar 5 °C o más entre calculadoras que suponen tampones distintos, así que pon las concentraciones de sodio, magnesio y dNTP de tu propia mezcla.
Cómo elegir la temperatura de hibridación
Empieza unos 5 °C por debajo de la Tm más baja de la pareja. Si no ves producto, bájala; si ves bandas de más, súbela. Una PCR en gradiente prueba un rango en una sola corrida. Algunas polimerasas de alta fidelidad traen sus propias reglas del fabricante para su tampón, que pueden dar otro punto de partida.
Reglas prácticas de diseño
- De 18 a 25 bases, con un 40% a 60% de GC.
- Las Tm de los dos cebadores a menos de unos 5 °C entre sí.
- Una G o C en el extremo 3', pero no más de 3 G o C en las últimas 5 bases.
- Sin series de 4 o más bases iguales ni tramos que se emparejen consigo mismos o con el otro cebador.
Calculadoras
La calculadora de Tm de cebadores usa termodinámica de vecinos más cercanos con tus concentraciones de sal, magnesio y cebador, y sugiere una temperatura de hibridación. Estadísticas de cebadores de PCR compara los tres métodos y avisa de horquillas, autodímeros y series.