Por qué usar una proporción molar
La ligación depende del número de extremos de ADN, no de su masa. Un inserto pequeño tiene muchas más moléculas por ng que un vector grande, así que masas iguales darían números de moléculas muy distintos. Por eso los protocolos dan una proporción molar entre inserto y vector, casi siempre 3:1.
La fórmula
inserto (ng) = vector (ng) × longitud del inserto ÷ longitud del vector × proporción
Con 50 ng de un vector de 3000 pb y un inserto de 1000 pb a 3:1: 50 × 1000 ÷ 3000 × 3 = 50 ng de inserto.
Consejos
- Prueba 1:1, 3:1 y 5:1 si el primer intento da pocas colonias.
- Los insertos muy cortos, como oligos hibridados, suelen necesitar proporciones más altas.
- Incluye una ligación solo con vector como control del fondo de vector sin cortar o religado.
- Mide las concentraciones después de purificar, no antes.
Calculadora
La Calculadora de ligación da los ng de inserto para cualquier proporción y, con la concentración del inserto, el volumen que hay que pipetear. Mide esa concentración con la Calculadora de concentración de ADN.
Un ejemplo con volúmenes
Con el ejemplo de arriba necesitas 50 ng de vector y 50 ng de inserto. Si el vector está a 50 ng/µL y el inserto a 25 ng/µL:
- Vector: 50 ÷ 50 = 1 µL.
- Inserto: 50 ÷ 25 = 2 µL.
- Tampón de ligasa 10×: 2 µL. ADN ligasa T4: 1 µL.
- Agua hasta 20 µL: 14 µL.
Comprobarlo en moles
Un par de bases de ADN de doble cadena pesa unos 650 g/mol, así que pmol = ng × 1.000 ÷ (pb × 650). El vector son 50.000 ÷ (3.000 × 650) ≈ 0,026 pmol y el inserto 50.000 ÷ (1.000 × 650) ≈ 0,077 pmol, el triple.
Pocas colonias o ninguna
- El ATP del tampón de ligasa se degrada con cada congelación y descongelación. Guarda el tampón en alícuotas pequeñas.
- Los extremos romos se ligan mucho peor que los cohesivos; usa más ligasa y una incubación más larga.
- Un vector desfosforilado necesita un inserto que conserve sus fosfatos 5′; los productos de PCR hechos con cebadores normales no los tienen.