Por qué usar una proporción molar
La ligación depende del número de extremos de ADN, no de su masa. Un inserto pequeño tiene muchas más moléculas por ng que un vector grande, así que masas iguales darían números de moléculas muy distintos. Por eso los protocolos dan una proporción molar entre inserto y vector, casi siempre 3:1.
La fórmula
inserto (ng) = vector (ng) × longitud del inserto ÷ longitud del vector × proporción
Con 50 ng de un vector de 3000 pb y un inserto de 1000 pb a 3:1: 50 × 1000 ÷ 3000 × 3 = 50 ng de inserto.
Consejos
- Prueba 1:1, 3:1 y 5:1 si el primer intento da pocas colonias.
- Los insertos muy cortos, como oligos hibridados, suelen necesitar proporciones más altas.
- Incluye una ligación solo con vector como control del fondo de vector sin cortar o religado.
- Mide las concentraciones después de purificar, no antes.
Calculadora
La Calculadora de ligación da los ng de inserto para cualquier proporción y, con la concentración del inserto, el volumen que hay que pipetear. Mide esa concentración con la Calculadora de concentración de ADN.