Cómo funciona el gel
El SDS recubre las proteínas de carga negativa en proporción a su longitud, así que en un campo eléctrico se mueven por la malla de poliacrilamida solo según su tamaño. El gel tiene dos capas: un gel concentrador corto, de pH y porcentaje bajos, que comprime cada muestra en una banda fina, y un gel separador debajo que separa las proteínas.
Elegir el porcentaje
- 8%: unos 40 a 200 kDa
- 10%: unos 20 a 150 kDa
- 12%: unos 15 a 100 kDa, una elección general habitual
- 15%: unos 10 a 70 kDa
El gel concentrador suele ser del 4% o 5%.
Qué hace cada ingrediente
- Acrilamida/bis: forma la malla del gel; su porcentaje fija el tamaño de poro.
- Tris-HCl: pH 8,8 a 0,375 M en el gel separador y pH 6,8 a 0,125 M en el concentrador. Esa diferencia de pH es lo que concentra las muestras.
- SDS: al 0,1%, mantiene las proteínas desnaturalizadas y cargadas.
- APS y TEMED: inician la polimerización. Añádelos al final, porque el gel empieza a fraguar en minutos.
Verter los geles
- Monta los cristales y comprueba con agua que no haya fugas.
- Mezcla el gel separador, añade APS y TEMED, agita y vierte hasta 1,5 cm por debajo de donde llegarán los dientes del peine.
- Cúbrelo con isopropanol o agua para que el borde quede plano y deja que fragüe de 20 a 30 minutos.
- Retira la capa de cobertura, mezcla el gel concentrador con su APS y TEMED, viértelo encima y coloca el peine.
- Deja que fragüe, quita el peine y enjuaga los pocillos.
La acrilamida sin polimerizar es neurotóxica: usa guantes y manipula las soluciones con cuidado.
Calculadoras
La calculadora de geles SDS-PAGE da todos los volúmenes de los geles separador y concentrador para cualquier porcentaje y número de geles. Para cargar la misma cantidad de proteína, mide tus muestras con la calculadora de concentración de proteínas.