जेल कैसे काम करता है
SDS प्रोटीन को उनकी लंबाई के अनुपात में ऋणात्मक आवेश से ढक देता है, इसलिए विद्युत क्षेत्र में वे पॉलीएक्रिलामाइड जाल में सिर्फ़ आकार के हिसाब से चलते हैं। जेल की दो परतें होती हैं: कम pH और कम प्रतिशत वाला छोटा स्टैकिंग जेल, जो हर नमूने को पतले बैंड में दबाता है, और उसके नीचे रिज़ॉल्विंग जेल, जो प्रोटीन अलग करता है।
प्रतिशत चुनें
- 8%: लगभग 40 से 200 kDa
- 10%: लगभग 20 से 150 kDa
- 12%: लगभग 15 से 100 kDa, आम सामान्य पसंद
- 15%: लगभग 10 से 70 kDa
स्टैकिंग जेल आमतौर पर 4% या 5% होता है।
हर सामग्री क्या करती है
- एक्रिलामाइड/बिस: जेल का जाल बनाता है; इसका प्रतिशत छिद्रों का आकार तय करता है।
- Tris-HCl: रिज़ॉल्विंग जेल में pH 8.8 पर 0.375 M, स्टैकिंग जेल में pH 6.8 पर 0.125 M। pH का यही अंतर नमूनों को स्टैक करता है।
- SDS: 0.1%, प्रोटीन को विकृत और आवेशित रखता है।
- APS और TEMED: पॉलीमराइज़ेशन शुरू करते हैं। इन्हें आख़िर में मिलाएँ, क्योंकि जेल मिनटों में जमने लगता है।
जेल डालें
- काँच की प्लेटें जोड़ें और पानी से रिसाव जाँचें।
- रिज़ॉल्विंग जेल मिलाएँ, APS और TEMED डालें, घुमाएँ और कंघी के दाँत जहाँ तक पहुँचेंगे उससे लगभग 1.5 cm नीचे तक डालें।
- किनारा सीधा रखने के लिए ऊपर आइसोप्रोपेनॉल या पानी डालें और 20 से 30 मिनट जमने दें।
- ऊपर की परत निकालें, स्टैकिंग जेल को उसके APS और TEMED के साथ मिलाएँ, ऊपर डालें और कंघी लगाएँ।
- जमने दें, फिर कंघी निकालें और वेल धोएँ।
बिना पॉलीमराइज़ हुआ एक्रिलामाइड तंत्रिका-विष है: दस्ताने पहनें और घोल सावधानी से संभालें।
कैलकुलेटर
SDS-PAGE जेल कैलकुलेटर किसी भी प्रतिशत और जेल संख्या के लिए रिज़ॉल्विंग और स्टैकिंग जेल का हर आयतन बताता है। बराबर प्रोटीन लोड करने के लिए नमूनों को प्रोटीन सांद्रता कैलकुलेटर से मापें।