Como fazer um gel de SDS-PAGE

Como o gel funciona

O SDS cobre as proteínas de carga negativa proporcional ao comprimento delas, então num campo elétrico elas se movem pela malha de poliacrilamida só de acordo com o tamanho. O gel tem duas camadas: um gel de empilhamento curto, de pH e porcentagem baixos, que comprime cada amostra numa banda fina, e um gel de separação abaixo, que separa as proteínas.

Escolha a porcentagem

8%: cerca de 40 a 200 kDa
10%: cerca de 20 a 150 kDa
12%: cerca de 15 a 100 kDa, uma escolha geral comum
15%: cerca de 10 a 70 kDa

O gel de empilhamento costuma ter 4% ou 5%.

O que cada ingrediente faz

Acrilamida/bis: forma a malha do gel; a porcentagem define o tamanho dos poros.
Tris-HCl: pH 8,8 a 0,375 M no gel de separação e pH 6,8 a 0,125 M no de empilhamento. Essa diferença de pH é o que empilha as amostras.
SDS: 0,1%, mantém as proteínas desnaturadas e carregadas.
APS e TEMED: iniciam a polimerização. Adicione por último, porque o gel começa a endurecer em minutos.

Verta os géis

Monte as placas de vidro e confira vazamentos com água.
Misture o gel de separação, adicione APS e TEMED, agite e verta até cerca de 1,5 cm abaixo de onde os dentes do pente vão chegar.
Cubra com isopropanol ou água para deixar a borda reta e deixe endurecer por 20 a 30 minutos.
Descarte a cobertura, misture o gel de empilhamento com APS e TEMED, verta por cima e coloque o pente.
Deixe endurecer, retire o pente e lave os poços.

A acrilamida não polimerizada é neurotóxica: use luvas e manuseie as soluções com cuidado.

Calculadoras

A calculadora de géis SDS-PAGE lista todos os volumes dos géis de separação e de empilhamento para qualquer porcentagem e número de géis. Para aplicar a mesma quantidade de proteína, meça as amostras com a calculadora de concentração de proteínas.

Ferramentas deste guia

Calculadora de géis SDS-PAGE Calculadora de concentração de proteínas (A280)

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