Como fazer uma curva padrão

Para que serve uma curva padrão

Muitos ensaios, como Bradford, BCA, ELISA e qPCR, dão uma leitura que sobe com a concentração, mas não numa quantidade fixa e conhecida. Medir ao mesmo tempo amostras de concentração conhecida, os padrões, mostra como leitura e concentração se relacionam naquele ensaio, e as amostras desconhecidas são lidas nessa relação.

Preparando os padrões

Use de 5 a 8 padrões cobrindo a faixa esperada, incluindo um branco (zero).
Prepare-os no mesmo tampão das amostras, para que o tampão afete os dois igualmente.
Faça-os por diluição de um mesmo estoque e meça-os em duplicata ou triplicata junto com as amostras.

Ajustando a reta

Coloque a leitura contra a concentração e ajuste uma reta, leitura = inclinação × concentração + intercepto, por mínimos quadrados. Depois, para cada amostra:

concentração = (leitura − intercepto) ÷ inclinação

Multiplique pelo fator de diluição se a amostra foi diluída antes da medida.

Um exemplo resolvido

Padrões de BSA de 0, 250, 500 e 1.000 µg/mL dão absorbâncias de 0,05, 0,37, 0,66 e 1,21. A reta ajustada é cerca de leitura = 0,00115 × concentração + 0,068. Uma amostra diluída 1:5 lê 0,48: (0,48 − 0,068) ÷ 0,00115 = 358 µg/mL no poço, ou cerca de 1,8 mg/mL na amostra original.

Avaliando a curva

Um R² acima de cerca de 0,99 é o comum. Um valor menor indica erro de pipetagem ou um ponto fora da curva.
Fique dentro dos padrões. Leituras acima do padrão mais alto são extrapoladas; dilua a amostra e meça de novo.
Atenção à curvatura. Muitos ensaios achatam em concentrações altas. Tire os padrões do topo que se desviam ou use uma faixa mais estreita.

Calculadoras

A calculadora de curva padrão ajusta a reta, dá o R² e calcula cada amostra com sua diluição. Planeje os padrões com a calculadora de diluição seriada; para proteínas purificadas, a calculadora de concentração de proteínas usa a A280 em vez de uma curva.

Ferramentas deste guia

Calculadora de curva padrão Calculadora de diluição seriada Calculadora de concentração de proteínas (A280)

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