Para qué sirve una curva estándar
Muchos ensayos, como Bradford, BCA, ELISA y qPCR, dan una lectura que sube con la concentración, pero no en una cantidad fija y conocida. Medir a la vez muestras de concentración conocida, los patrones, muestra cómo se relacionan lectura y concentración en ese ensayo, y las muestras desconocidas se leen sobre esa relación.
Preparar los patrones
- Usa de 5 a 8 patrones que cubran el rango esperado, incluido un blanco (cero).
- Prepáralos en el mismo tampón que las muestras, para que el tampón afecte a ambos por igual.
- Hazlos por dilución a partir de un mismo stock y mídelos por duplicado o triplicado junto a las muestras.
Ajustar la recta
Representa la lectura frente a la concentración y ajusta una recta, lectura = pendiente × concentración + intercepto, por mínimos cuadrados. Después, para cada muestra:
concentración = (lectura − intercepto) ÷ pendiente
Multiplica por el factor de dilución si diluiste la muestra antes de medirla.
Un ejemplo resuelto
Patrones de BSA de 0, 250, 500 y 1000 µg/mL dan absorbancias de 0,05, 0,37, 0,66 y 1,21. La recta ajustada es aproximadamente lectura = 0,00115 × concentración + 0,068. Una muestra diluida 1:5 lee 0,48: (0,48 − 0,068) ÷ 0,00115 = 358 µg/mL en el pocillo, o unos 1,8 mg/mL en la muestra original.
Valorar la curva
- Un R² por encima de 0,99 es lo habitual. Un valor menor apunta a un error de pipeteo o un valor atípico.
- Quédate dentro de los patrones. Las lecturas por encima del patrón más alto se extrapolan; diluye la muestra y vuelve a medir.
- Vigila la curvatura. Muchos ensayos se aplanan a concentraciones altas. Quita los patrones superiores que se desvían o usa un rango más estrecho.
Calculadoras
La calculadora de curva estándar ajusta la recta, da el R² y calcula cada muestra con su dilución. Planifica los patrones con la calculadora de diluciones seriadas; para proteínas purificadas, la calculadora de concentración de proteínas usa la A280 en lugar de una curva.