Por qué las proteínas absorben a 280 nm
El triptófano y la tirosina absorben luz ultravioleta a 280 nm, y los puentes disulfuro aportan un poco. Como la cantidad de cada uno varía entre proteínas, cada proteína tiene su propio coeficiente de extinción, y la lectura de A280 es tan buena como el coeficiente que uses.
La fórmula
Según la ley de Beer-Lambert, concentración (M) = A280 ÷ (ε × paso óptico), donde ε es el coeficiente de extinción molar en M−1 cm−1. Multiplica por el peso molecular para obtener mg/mL. Un atajo es la Abs 0,1%, la absorbancia de una solución de 1 mg/mL, que es ε ÷ peso molecular: mg/mL = A280 ÷ Abs 0,1%.
El coeficiente de extinción a partir de la secuencia
El método de Pace y colaboradores (1995) cuenta los residuos que absorben:
ε = 5500 × Trp + 1490 × Tyr + 125 × cistinas
Una cistina es un par de cisteínas unidas por un puente disulfuro; quita ese término si la proteína está reducida.
Un ejemplo resuelto
La albúmina de suero bovino tiene ε = 43 824 M−1 cm−1 y un peso molecular de 66 430 Da, así que su Abs 0,1% es 43 824 ÷ 66 430 = 0,66. Una lectura de 0,33 en una cubeta de 1 cm es 0,33 ÷ 0,66 = 0,5 mg/mL, o 7,5 µM.
Errores comunes
- Haz el blanco con el mismo tampón de la proteína; el imidazol, los detergentes y algunos reductores absorben a 280 nm.
- La contaminación con ácidos nucleicos eleva la A280. Una proteína pura tiene una relación A260/A280 de alrededor de 0,6; valores cercanos a 1 o mayores indican ADN o ARN.
- Los agregados dispersan la luz y dan lecturas altas. Centrifuga o filtra las muestras turbias.
- Mantén las lecturas entre 0,1 y 1,0, diluyendo si hace falta.
- Las proteínas sin triptófano ni tirosina no se pueden medir así; usa un ensayo de Bradford o BCA.
Calculadoras
La calculadora de concentración de proteínas calcula el coeficiente de extinción a partir de una secuencia pegada, o usa un coeficiente conocido o la Abs 0,1%, y da mg/mL y µM. La calculadora de la ley de Beer-Lambert resuelve la ecuación general y Peso molecular de proteínas da la masa a partir de una secuencia.