Pourquoi les protéines absorbent à 280 nm
Le tryptophane et la tyrosine absorbent la lumière ultraviolette à 280 nm, et les ponts disulfure ajoutent un peu. Comme leur nombre varie d’une protéine à l’autre, chaque protéine a son propre coefficient d’extinction, et une mesure d’A280 ne vaut que par le coefficient utilisé.
La formule
D’après la loi de Beer-Lambert, concentration (M) = A280 ÷ (ε × trajet optique), où ε est le coefficient d’extinction molaire en M−1 cm−1. Multipliez par la masse moléculaire pour obtenir des mg/mL. Un raccourci est l’Abs 0,1 %, l’absorbance d’une solution à 1 mg/mL, soit ε ÷ masse moléculaire : mg/mL = A280 ÷ Abs 0,1 %.
Le coefficient d’extinction d’après la séquence
La méthode de Pace et collègues (1995) compte les résidus qui absorbent :
ε = 5 500 × Trp + 1 490 × Tyr + 125 × cystines
Une cystine est une paire de cystéines reliées par un pont disulfure ; retirez ce terme pour une protéine réduite.
Un exemple
L’albumine sérique bovine a ε = 43 824 M−1 cm−1 et une masse moléculaire de 66 430 Da, donc une Abs 0,1 % de 43 824 ÷ 66 430 = 0,66. Une mesure de 0,33 dans une cuve de 1 cm donne 0,33 ÷ 0,66 = 0,5 mg/mL, soit 7,5 µM.
Pièges
- Faites le blanc avec le même tampon que la protéine ; l’imidazole, les détergents et certains réducteurs absorbent à 280 nm.
- Une contamination par des acides nucléiques augmente l’A280. Une protéine pure a un rapport A260/A280 d’environ 0,6 ; des valeurs proches de 1 ou plus signalent de l’ADN ou de l’ARN.
- Les agrégats diffusent la lumière et donnent des valeurs trop hautes. Centrifugez ou filtrez les échantillons troubles.
- Gardez les mesures entre 0,1 et 1,0 environ, en diluant si besoin.
- Les protéines sans tryptophane ni tyrosine ne se mesurent pas ainsi ; utilisez un dosage de Bradford ou BCA.
Calculateurs
Le calcul de la concentration en protéines obtient le coefficient d’extinction à partir d’une séquence collée, ou utilise un coefficient connu ou l’Abs 0,1 %, et donne des mg/mL et des µM. Le calcul de la loi de Beer-Lambert résout l’équation générale, et Masse moléculaire des protéines donne la masse d’une séquence.