Pourquoi un rapport molaire
La ligation dépend du nombre d’extrémités d’ADN, pas de leur masse. Un petit insert contient beaucoup plus de molécules par ng qu’un grand vecteur : des masses égales donneraient donc des nombres de molécules très différents. C’est pourquoi les protocoles indiquent un rapport molaire entre insert et vecteur, le plus souvent 3:1.
La formule
insert (ng) = vecteur (ng) × taille de l’insert ÷ taille du vecteur × rapport
Avec 50 ng d’un vecteur de 3 000 pb et un insert de 1 000 pb à 3:1 : 50 × 1 000 ÷ 3 000 × 3 = 50 ng d’insert.
Conseils
- Essayez 1:1, 3:1 et 5:1 si le premier essai donne peu de colonies.
- Les inserts très courts, comme des oligos hybridés, demandent souvent des rapports plus élevés.
- Prévoyez une ligation avec le vecteur seul, comme témoin du bruit de fond dû au vecteur non coupé ou refermé sur lui-même.
- Mesurez les concentrations après la purification, pas avant.
L’outil
Le Calcul de ligation donne les ng d’insert pour n’importe quel rapport et, avec la concentration de l’insert, le volume à pipeter. Mesurez cette concentration avec le Calcul de concentration d’ADN.
Un exemple avec les volumes
D’après l’exemple ci-dessus, il faut 50 ng de vecteur et 50 ng d’insert. Si le vecteur est à 50 ng/µL et l’insert à 25 ng/µL :
- Vecteur : 50 ÷ 50 = 1 µL.
- Insert : 50 ÷ 25 = 2 µL.
- Tampon de ligase 10× : 2 µL. ADN ligase T4 : 1 µL.
- Eau jusqu’à 20 µL : 14 µL.
Le vérifier en moles
Une paire de bases d’ADN double brin pèse environ 650 g/mol, donc pmol = ng × 1 000 ÷ (pb × 650). Le vecteur fait 50 000 ÷ (3 000 × 650) ≈ 0,026 pmol et l’insert 50 000 ÷ (1 000 × 650) ≈ 0,077 pmol, trois fois plus.
Peu ou pas de colonies
- L’ATP du tampon de ligase se dégrade à chaque congélation et décongélation. Conservez le tampon en petites aliquotes.
- Les extrémités franches se lient bien moins facilement que les extrémités cohésives ; utilisez plus de ligase et une incubation plus longue.
- Un vecteur déphosphorylé exige un insert qui a encore ses phosphates en 5′ ; les produits de PCR faits avec des amorces ordinaires n’en ont pas.