Pourquoi un rapport molaire
La ligation dépend du nombre d’extrémités d’ADN, pas de leur masse. Un petit insert contient beaucoup plus de molécules par ng qu’un grand vecteur : des masses égales donneraient donc des nombres de molécules très différents. C’est pourquoi les protocoles indiquent un rapport molaire entre insert et vecteur, le plus souvent 3:1.
La formule
insert (ng) = vecteur (ng) × taille de l’insert ÷ taille du vecteur × rapport
Avec 50 ng d’un vecteur de 3 000 pb et un insert de 1 000 pb à 3:1 : 50 × 1 000 ÷ 3 000 × 3 = 50 ng d’insert.
Conseils
- Essayez 1:1, 3:1 et 5:1 si le premier essai donne peu de colonies.
- Les inserts très courts, comme des oligos hybridés, demandent souvent des rapports plus élevés.
- Prévoyez une ligation avec le vecteur seul, comme témoin du bruit de fond dû au vecteur non coupé ou refermé sur lui-même.
- Mesurez les concentrations après la purification, pas avant.
L’outil
Le Calcul de ligation donne les ng d’insert pour n’importe quel rapport et, avec la concentration de l’insert, le volume à pipeter. Mesurez cette concentration avec le Calcul de concentration d’ADN.