La formule
viabilité (%) = cellules vivantes ÷ (cellules vivantes + cellules mortes) × 100
Comptez les vivantes et les mortes dans les mêmes carrés, pour que la dilution et le volume de la chambre s'annulent ; la viabilité est un rapport et n'a pas besoin d'être convertie en cellules par mL.
Comment agit le bleu trypan
Le bleu trypan ne traverse pas une membrane cellulaire intacte. Les cellules vivantes l'excluent et restent claires au microscope ; les cellules mortes, à la membrane abîmée, l'absorbent et deviennent bleues. Mélangez cellules et bleu trypan à 0,4 % à parts égales, attendez au plus quelques minutes et comptez : le colorant est toxique et, après environ 5 minutes, les cellules vivantes commencent aussi à se colorer, ce qui fait paraître la viabilité pire qu'elle n'est.
Un exemple chiffré
Quatre grands carrés donnent 58, 62, 55 et 61 cellules vivantes (moyenne 59) et 6, 8, 5 et 9 mortes (moyenne 7).
- Viabilité = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89 %.
- Cellules vivantes par mL = 59 × 2 (dilution du bleu trypan) × 104 = 1,18 × 106.
Utilisez le compte des vivantes, pas le total, pour calculer la quantité à ensemencer.
Ce qui est acceptable
Les cultures saines en phase exponentielle dépassent 90 % de viabilité, et la plupart des expériences exigent au moins 85 à 90 %. Des cellules fraîchement décongelées peuvent être à 60 ou 80 % et se rétablissent après un passage. Les cellules détachées à la trypsine perdent quelques pour cent ; celles laissées trop longtemps dans la trypsine, pipetées brutalement ou gardées une heure sur glace en perdent davantage. Une baisse de viabilité entre deux passages est un signe précoce de contamination, de milieu épuisé ou de problème d'incubateur.
Erreurs fréquentes
- Compter les débris et fragments colorés comme cellules mortes abaisse le chiffre ; compter des cellules pâles et gonflées comme vivantes l'élève.
- Les cellules mortes se lysent et disparaissent en culture ; un comptage de viabilité ne montre donc que la mort récente, pas tout ce qui est mort.
- Le bleu trypan rate les cellules en apoptose précoce, qui excluent encore le colorant ; utilisez l'annexine V ou un colorant comme l'iodure de propidium en cytométrie en flux quand cela compte.
Outils
Calcul avec hématimètre prend les comptages de vivantes et de mortes et donne la viabilité et les cellules vivantes par mL. Calcul d’ensemencement cellulaire calcule le volume à pipeter, et Calcul du temps de doublement suit la croissance entre les passages.