La fórmula
viabilidad (%) = células vivas ÷ (células vivas + células muertas) × 100
Cuenta las vivas y las muertas en los mismos cuadrados, para que la dilución y el volumen de la cámara se cancelen; la viabilidad es un cociente y no hace falta convertirla a células por mL.
Cómo funciona el azul de tripano
El azul de tripano no atraviesa una membrana celular intacta. Las células vivas lo excluyen y se ven brillantes al microscopio; las muertas, con la membrana dañada, lo captan y se tiñen de azul. Mezcla células y azul de tripano al 0,4 % en proporción 1:1, espera como mucho unos minutos y cuenta: el colorante es tóxico y pasados unos 5 minutos las células vivas también empiezan a teñirse, lo que hace que la viabilidad parezca peor de lo que es.
Un ejemplo resuelto
Cuatro cuadrados grandes dan recuentos de vivas de 58, 62, 55 y 61 (media 59) y de muertas de 6, 8, 5 y 9 (media 7).
- Viabilidad = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89 %.
- Células vivas por mL = 59 × 2 (dilución del azul de tripano) × 104 = 1,18 × 106.
Usa el recuento de vivas, no el total, cuando calcules cuánto sembrar.
Qué es aceptable
Los cultivos sanos en fase logarítmica superan el 90 % de viabilidad, y la mayoría de experimentos exigen al menos un 85 a 90 %. Las células recién descongeladas pueden estar al 60 u 80 % y se recuperan tras un pase. Las células despegadas con tripsina pierden unos puntos; las que pasan demasiado tiempo en tripsina, se pipetean con brusquedad o se dejan una hora en hielo pierden más. Una caída de viabilidad entre pases es un signo temprano de contaminación, medio agotado o un problema del incubador.
Errores comunes
- Contar restos y fragmentos teñidos como células muertas baja el número; contar como vivas células tenues e hinchadas lo sube.
- Las células muertas se lisan y desaparecen en el cultivo, así que un recuento de viabilidad solo muestra la muerte reciente, no todo lo que murió.
- El azul de tripano no detecta las células en apoptosis temprana, que aún excluyen el colorante; usa anexina V o un colorante como el yoduro de propidio con citometría de flujo cuando eso importe.
Calculadoras
La Calculadora de hemocitómetro toma recuentos de vivas y muertas y da la viabilidad y las células vivas por mL. La Calculadora de siembra celular calcula cuánto pipetear, y la Calculadora de tiempo de duplicación celular sigue el crecimiento entre pases.