La fórmula
copias = (masa en ng × 6,022 × 1023) ÷ (longitud en pb × 660 × 109)
660 g/mol es la masa media de un par de bases de ADN de doble hebra (unos 330 por base en ADN de hebra sencilla y 340 en ARN), 6,022 × 1023 es el número de Avogadro y 109 convierte nanogramos en gramos. Cuanto más larga la molécula, menos copias caben en un nanogramo.
Un ejemplo resuelto
¿Cuántas moléculas hay en 1 ng de un plásmido de 5.000 pb?
- Masa molar: 5.000 × 660 = 3,3 × 106 g/mol.
- Moles: 1 × 10−9 g ÷ 3,3 × 106 g/mol = 3,03 × 10−16 mol.
- Copias: 3,03 × 10−16 × 6,022 × 1023 = 1,8 × 108 copias.
Una regla práctica: 1 ng de un fragmento de 1 kb son unas 9 × 108 copias, y 1 ng de 1 pb serían 9 × 1011, así que divide entre la longitud en pb.
De copias a masa
Reordenada: masa (ng) = copias × longitud × 660 × 109 ÷ 6,022 × 1023. Para 106 copias del mismo plásmido son 106 × 5.000 × 660 × 109 ÷ 6,022 × 1023 = 5,5 × 10−3 ng, es decir, 5,5 pg.
Una curva patrón de qPCR
La cuantificación absoluta necesita patrones con un número conocido de copias. Mide la concentración del plásmido, conviértela en copias por µL y haz diluciones seriadas 1:10 desde, por ejemplo, 108 hasta 102 copias por µL. Córrelas junto a las muestras; la gráfica de Ct frente al log de copias debe ser una recta con pendiente cercana a −3,3 (eficiencia del 100 %). El plásmido linealizado da patrones más exactos que el superenrollado, y un portador como ARNt o ARN de levadura evita que las diluciones de pocas copias se peguen a las paredes del tubo.
Calculadoras
La Calculadora de número de copias de ADN convierte entre nanogramos y copias para ADN o ARN de cualquier longitud. Obtén la concentración a partir de una lectura de A260 con la Calculadora de concentración de ADN; para cuantificación relativa en lugar de absoluta, usa la Calculadora ΔΔCt.