Como calcular o número de cópias de DNA

A fórmula

cópias = (massa em ng × 6,022 × 10²³) ÷ (comprimento em pb × 660 × 10⁹)

660 g/mol é a massa média de um par de bases de DNA de fita dupla (cerca de 330 por base para DNA de fita simples e 340 para RNA), 6,022 × 10²³ é o número de Avogadro e 10⁹ converte nanogramas em gramas. Quanto mais longa a molécula, menos cópias cabem num nanograma.

Um exemplo resolvido

Quantas moléculas há em 1 ng de um plasmídeo de 5.000 pb?

1. Massa molar: 5.000 × 660 = 3,3 × 10⁶ g/mol.
2. Mols: 1 × 10⁻⁹ g ÷ 3,3 × 10⁶ g/mol = 3,03 × 10⁻¹⁶ mol.
3. Cópias: 3,03 × 10⁻¹⁶ × 6,022 × 10²³ = 1,8 × 10⁸ cópias.

Uma regra prática: 1 ng de um fragmento de 1 kb são cerca de 9 × 10⁸ cópias, e 1 ng de 1 pb seriam 9 × 10¹¹, então divida pelo comprimento em pb.

De cópias para massa

Rearranjada: massa (ng) = cópias × comprimento × 660 × 10⁹ ÷ 6,022 × 10²³. Para 10⁶ cópias do mesmo plasmídeo são 10⁶ × 5.000 × 660 × 10⁹ ÷ 6,022 × 10²³ = 5,5 × 10⁻³ ng, ou 5,5 pg.

Uma curva padrão de qPCR

A quantificação absoluta precisa de padrões com número conhecido de cópias. Meça a concentração do plasmídeo, converta em cópias por µL e faça diluições seriadas de 10 vezes de, por exemplo, 10⁸ até 10² cópias por µL. Corra-as junto com as amostras; o gráfico de Ct contra o log das cópias deve ser uma reta com inclinação perto de −3,3 (eficiência de 100%). Plasmídeo linearizado dá padrões mais exatos que o superenovelado, e um carreador como tRNA ou RNA de levedura evita que as diluições de poucas cópias grudem nas paredes do tubo.

Calculadoras

A Calculadora de número de cópias de DNA converte entre nanogramas e cópias para DNA ou RNA de qualquer comprimento. Obtenha a concentração a partir de uma leitura de A260 com a Calculadora de concentração de DNA; para quantificação relativa em vez de absoluta, use a Calculadora ΔΔCt.