Como calcular a Tm de um primer e a temperatura de anelamento

O que é a Tm

A temperatura de fusão (Tm) é a temperatura em que metade do primer está ligada ao alvo e metade está livre. O anelamento do PCR é ajustado um pouco abaixo dela, para que os primers se liguem com firmeza, mas só no lugar certo.

Três formas de calcular

A regra de Wallace, para primers com menos de umas 14 bases: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C). É rápida, mas ignora a ordem das bases e o tampão.
A fórmula do GC, para primers mais longos: Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) ÷ comprimento. Um primer de 20 bases com 10 G ou C dá 64,9 + 41 × (10 − 16,4) ÷ 20 = 51,8 °C.
A termodinâmica de vizinhos mais próximos, a mais precisa: soma a energia de empilhamento de cada par de bases vizinhas e corrige pela concentração do primer e pelo sal da reação.

Por que o tampão importa

Os cátions neutralizam a carga negativa do esqueleto do DNA, então mais sal significa uma Tm mais alta. O magnésio tem um efeito muito maior que o sódio, e os dNTPs prendem parte dele. O mesmo primer pode variar 5 °C ou mais entre calculadoras que supõem tampões diferentes, então informe as concentrações de sódio, magnésio e dNTPs da sua mistura.

Como escolher a temperatura de anelamento

Comece cerca de 5 °C abaixo da menor Tm do par. Se não houver produto, abaixe; se aparecerem bandas a mais, suba. Um PCR em gradiente testa uma faixa numa só corrida. Algumas polimerases de alta fidelidade têm regras próprias do fabricante para seu tampão, que podem dar outro ponto de partida.

Regras práticas de desenho

De 18 a 25 bases, com 40% a 60% de GC.
As Tm dos dois primers a menos de uns 5 °C uma da outra.
Um G ou C na ponta 3', mas no máximo 3 G ou C nas últimas 5 bases.
Sem sequências de 4 ou mais bases iguais nem trechos que pareiem consigo mesmos ou com o outro primer.

Calculadoras

A calculadora de Tm de primers usa termodinâmica de vizinhos mais próximos com suas concentrações de sal, magnésio e primer, e sugere uma temperatura de anelamento. Estatísticas de primers de PCR compara os três métodos e alerta sobre grampos, autodímeros e repetições.

Ferramentas deste guia

Calculadora de Tm de primers Análise de primers de PCR

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