Calculadora de Tm de primers

Como calcular a Tm de um primer

1. Cole o primer direto e, se tiver, o reverso, escritos de 5' para 3'.
2. Ajuste as concentrações de primer, sódio, magnésio e dNTPs da sua mistura de PCR.
3. A Tm de cada primer aparece com o comprimento, o conteúdo de GC, a diferença entre os dois e uma temperatura de anelamento inicial.

Perguntas frequentes

Qual método é usado?

Termodinâmica de vizinhos mais próximos com os parâmetros de SantaLucia (1998). O magnésio é contado como sódio extra, Na⁺ + 120 × √(Mg²⁺ − dNTPs), segundo von Ahsen et al. (2001).

Que temperatura de anelamento devo usar?

Um ponto de partida comum é 5 °C abaixo da menor das duas Tm; um PCR em gradiente encontra a melhor. Algumas polimerases, como as de alta fidelidade com seus próprios tampões, têm calculadora e regras do fabricante, que dão valores diferentes.

Quão próximas devem ser as duas Tm?

Até cerca de 5 °C de diferença, para que os dois primers se liguem bem na mesma temperatura de anelamento.