Kalkulator Tm Primer

Cara menghitung Tm primer

1. Tempel primer forward dan, jika ada, primer reverse, ditulis dari 5' ke 3'.
2. Atur konsentrasi primer, natrium, magnesium, dan dNTP campuran PCR Anda.
3. Tm setiap primer muncul beserta panjang, kandungan GC, selisih keduanya, dan suhu annealing awal.

Pertanyaan umum

Metode apa yang dipakai?

Termodinamika nearest-neighbor dengan parameter SantaLucia (1998). Magnesium dihitung sebagai natrium tambahan, Na⁺ + 120 × √(Mg²⁺ − dNTP), mengikuti von Ahsen dkk. (2001).

Suhu annealing berapa yang sebaiknya dipakai?

Titik awal yang umum adalah 5 °C di bawah Tm yang lebih rendah; PCR gradien menemukan yang terbaik. Beberapa polimerase, seperti enzim high-fidelity dengan buffernya sendiri, punya kalkulator dan aturan Tm dari produsennya yang memberi angka berbeda.

Seberapa dekat kedua Tm sebaiknya?

Selisihnya sekitar 5 °C atau kurang, agar kedua primer menempel dengan baik pada suhu annealing yang sama.