Tm का मतलब
गलन तापमान (Tm) वह तापमान है जिस पर आधा प्राइमर अपने लक्ष्य से जुड़ा होता है और आधा मुक्त। PCR का एनीलिंग चरण इससे थोड़ा नीचे रखा जाता है, ताकि प्राइमर मज़बूती से जुड़ें लेकिन केवल सही जगह पर।
निकालने के तीन तरीके
- वालेस नियम, लगभग 14 बेस से छोटे प्राइमर के लिए: Tm = 2 × (A + T) + 4 × (G + C)। तेज़ है, लेकिन बेस का क्रम और बफ़र नहीं देखता।
- GC सूत्र, लंबे प्राइमर के लिए: Tm = 64.9 + 41 × (G + C − 16.4) ÷ लंबाई। 10 G या C वाले 20-मर से 64.9 + 41 × (10 − 16.4) ÷ 20 = 51.8 °C मिलता है।
- नियरेस्ट-नेबर ऊष्मागतिकी, सबसे सटीक: यह पड़ोसी बेस की हर जोड़ी की स्टैकिंग ऊर्जा जोड़ती है, फिर प्राइमर सांद्रता और अभिक्रिया के नमक के हिसाब से सुधार करती है।
बफ़र क्यों मायने रखता है
धनायन DNA की रीढ़ के ऋणात्मक आवेश को ढकते हैं, इसलिए ज़्यादा नमक का मतलब ज़्यादा Tm है। मैग्नीशियम का असर सोडियम से कहीं ज़्यादा होता है, और dNTP उसका कुछ हिस्सा बाँध लेते हैं। अलग बफ़र मानने वाले कैलकुलेटरों में एक ही प्राइमर का Tm 5 °C या ज़्यादा अलग आ सकता है, इसलिए अपने मिश्रण की सोडियम, मैग्नीशियम और dNTP सांद्रता डालें।
एनीलिंग तापमान चुनना
जोड़ी के कम Tm से लगभग 5 °C नीचे से शुरू करें। उत्पाद न दिखे तो घटाएँ; अतिरिक्त बैंड दिखें तो बढ़ाएँ। ग्रेडिएंट PCR एक बार में एक सीमा जाँच लेता है। कुछ हाई-फ़िडेलिटी पॉलीमरेज़ अपने बफ़र के लिए निर्माता के अपने नियम देते हैं, जिनसे अलग शुरुआती बिंदु मिल सकता है।
प्राइमर डिज़ाइन के मोटे नियम
- 18 से 25 बेस लंबा, 40% से 60% GC।
- दोनों प्राइमर के Tm में लगभग 5 °C से कम अंतर।
- 3' सिरे पर G या C, लेकिन आख़िरी 5 बेस में 3 से ज़्यादा G या C नहीं।
- एक ही बेस की 4 या ज़्यादा की लड़ी नहीं, और ऐसे हिस्से नहीं जो ख़ुद से या दूसरे प्राइमर से जुड़ें।
कैलकुलेटर
प्राइमर Tm कैलकुलेटर आपकी नमक, मैग्नीशियम और प्राइमर सांद्रता के साथ नियरेस्ट-नेबर ऊष्मागतिकी इस्तेमाल करता है और एनीलिंग तापमान सुझाता है। PCR प्राइमर आँकड़े तीनों विधियों की तुलना करता है और हेयरपिन, सेल्फ़-डाइमर और लड़ियों की चेतावनी देता है।