मोलर अनुपात क्यों
लाइगेशन DNA सिरों की संख्या पर निर्भर करता है, द्रव्यमान पर नहीं। छोटे इंसर्ट में प्रति ng बड़े वेक्टर से कहीं ज़्यादा अणु होते हैं, इसलिए बराबर द्रव्यमान से अणुओं की संख्या बहुत अलग होगी। इसीलिए प्रोटोकॉल इंसर्ट और वेक्टर का मोलर अनुपात देते हैं, सबसे आम 3:1।
फ़ॉर्मूला
इंसर्ट (ng) = वेक्टर (ng) × इंसर्ट की लंबाई ÷ वेक्टर की लंबाई × अनुपात
3,000 bp वेक्टर के 50 ng और 1,000 bp इंसर्ट के साथ 3:1 पर: 50 × 1,000 ÷ 3,000 × 3 = 50 ng इंसर्ट।
सुझाव
- पहली कोशिश में कम कॉलोनी आएँ तो 1:1, 3:1 और 5:1 आज़माएँ।
- बहुत छोटे इंसर्ट, जैसे एनील किए ओलिगो, को अक्सर ज़्यादा अनुपात चाहिए।
- बिना कटे या खुद जुड़ गए वेक्टर की बैकग्राउंड जाँचने के लिए सिर्फ़ वेक्टर वाला लाइगेशन कंट्रोल रखें।
- सांद्रता प्यूरिफ़िकेशन के बाद मापें, पहले नहीं।
कैलकुलेटर
लाइगेशन कैलकुलेटर किसी भी अनुपात के लिए इंसर्ट के ng देता है और, इंसर्ट की सांद्रता के साथ, पिपेट करने का आयतन भी। वह सांद्रता DNA सांद्रता कैलकुलेटर से मापें।
वॉल्यूम के साथ एक उदाहरण
ऊपर के उदाहरण से आपको 50 ng वेक्टर और 50 ng इन्सर्ट चाहिए। अगर वेक्टर 50 ng/µL और इन्सर्ट 25 ng/µL पर है:
- वेक्टर: 50 ÷ 50 = 1 µL।
- इन्सर्ट: 50 ÷ 25 = 2 µL।
- 10× लाइगेज़ बफ़र: 2 µL। T4 DNA लाइगेज़: 1 µL।
- 20 µL तक पानी: 14 µL।
मोल में जाँच
डबल-स्ट्रैंडेड DNA का एक बेस पेयर लगभग 650 g/mol का होता है, इसलिए pmol = ng × 1,000 ÷ (bp × 650)। वेक्टर 50,000 ÷ (3,000 × 650) ≈ 0.026 pmol और इन्सर्ट 50,000 ÷ (1,000 × 650) ≈ 0.077 pmol है, तीन गुना।
कम या कोई कॉलोनी नहीं
- लाइगेज़ बफ़र का ATP बार-बार जमाने और पिघलाने से टूटता है। बफ़र छोटे-छोटे एलिकोट में रखें।
- ब्लंट एंड, स्टिकी एंड की तुलना में बहुत कम आसानी से जुड़ते हैं; ज़्यादा लाइगेज़ और लंबा इनक्यूबेशन लें।
- डीफ़ॉस्फ़ोरिलेटेड वेक्टर को ऐसा इन्सर्ट चाहिए जिसके 5′ फ़ॉस्फ़ेट बचे हों; साधारण प्राइमरों से बने PCR उत्पादों में ये नहीं होते।