qPCR प्राइमर सामान्य PCR प्राइमर से कैसे अलग हैं
qPCR यह नापता है कि हर चक्र में प्रोडक्ट कितनी तेज़ी से बनता है, इसलिए प्राइमर को अपने लक्ष्य को लगभग 100% दक्षता से कॉपी करना होता है और सिर्फ़ एक प्रोडक्ट बनाना होता है। इसके लिए छोटे एम्प्लिकॉन और क्लोनिंग PCR से सख़्त नियम चाहिए, जहाँ सही बैंड की कोई भी मात्रा काफ़ी होती है। सामान्य नियम PCR प्राइमर कैसे डिज़ाइन करें में हैं; यहाँ वे नियम हैं जो qPCR में बदलते हैं।
नियम
- एम्प्लिकॉन: लगभग 70 से 150 bp। छोटा प्रोडक्ट हर चक्र में पूरा कॉपी होता है, जिससे दक्षता ऊँची रहती है।
- प्राइमर की लंबाई: 18 से 25 बेस।
- Tm: लगभग 58 से 62 °C, दोनों प्राइमर एक-दूसरे से 1 से 2 °C के भीतर, आपके मास्टर मिक्स के नमक और मैग्नीशियम के हिसाब से निकाला गया।
- GC मात्रा: 40% से 60%, और 3′ सिरे के आख़िरी 5 बेस में 3 से ज़्यादा G या C नहीं।
- इनसे बचें: एक ही बेस के 4 या ज़्यादा की लड़ी, ख़ासकर G की, और ऐसे हिस्से जो उसी प्राइमर या दूसरे प्राइमर से जोड़ी बनाएँ। प्राइमर डाइमर SYBR Green में सबसे ज़्यादा मायने रखते हैं, क्योंकि वह डाइमर समेत हर दोहरे स्ट्रैंड वाले DNA को चमका देता है।
प्रोब
हाइड्रोलिसिस (TaqMan) प्रोब दोनों प्राइमर के बीच जुड़ता है और उसका Tm प्राइमर से लगभग 5 से 10 °C ऊपर रखा जाता है, ताकि प्राइमर के बढ़ने से पहले वह जुड़ चुका हो। उसके 5′ सिरे पर, रिपोर्टर डाई के पास, G न रखें, क्योंकि वहाँ G फ़्लोरेसेंस को दबा देता है।
mRNA नापना: एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन पार करें
cDNA से जीन एक्सप्रेशन के लिए एक प्राइमर को एक्सॉन-एक्सॉन जंक्शन के ऊपर रखें, या दोनों प्राइमर अलग-अलग एक्सॉन में रखें जिनके बीच लंबा इंट्रॉन हो। तब RNA में बचा जीनोमिक DNA कोई प्रोडक्ट नहीं देता, या इतना लंबा देता है कि ठीक से एम्प्लिफ़ाई न हो। नो-RT कंट्रोल, यानी रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ के बिना रिएक्शन से गुज़रा RNA, दिखाता है कि जीनोमिक DNA अब भी आ रहा है या नहीं।
ऑर्डर से पहले प्राइमर जाँचें
- दोनों Tm प्राइमर Tm कैलकुलेटर से निकालें, अपने मास्टर मिक्स के मैग्नीशियम के साथ, जो अक्सर 3 mM या ज़्यादा होता है।
- PCR Primer Stats से हेयरपिन, सेल्फ़-डाइमर और कमज़ोर या ज़्यादा चिपकने वाला 3′ सिरा देखें।
- टेम्पलेट को PCR Products में पेस्ट करके पक्का करें कि अपेक्षित आकार का एक ही प्रोडक्ट बनता है, और दूसरे लक्ष्यों को हटाने के लिए प्राइमर को पूरे जीनोम में खोजें, जैसे NCBI Primer-BLAST से।
लैब में जाँचें
टेम्पलेट की डाइल्यूशन सीरीज़ बनाएँ, 10 गुना के पाँच या ज़्यादा चरण, और स्टैंडर्ड कर्व कैलकुलेटर से Ct को मात्रा के लॉग के सामने प्लॉट करें। ढलान से दक्षता मिलती है: E = 10−1/ढलान − 1। −3.32 का ढलान 100% है, और 90% से 110% आम तौर पर स्वीकार्य है। SYBR Green में एक तीखी चोटी वाला मेल्ट कर्व एक ही प्रोडक्ट दिखाता है, और नो-टेम्पलेट कंट्रोल सपाट रहना चाहिए। फिर ΔΔCt कैलकुलेटर से सापेक्ष एक्सप्रेशन निकालें, जो दोनों प्राइमर जोड़ों की दक्षता अलग होने पर Pfaffl विधि इस्तेमाल करता है।