स्टैंडर्ड कर्व क्या करती है
Bradford, BCA, ELISA और qPCR जैसे कई परीक्षण ऐसी रीडिंग देते हैं जो सांद्रता के साथ बढ़ती है, लेकिन किसी तय और ज्ञात मात्रा में नहीं। ज्ञात सांद्रता वाले नमूनों, यानी मानकों, को साथ में मापने से उस रन में रीडिंग और सांद्रता का रिश्ता पता चलता है, और अज्ञात नमूने उसी रिश्ते से पढ़े जाते हैं।
मानक तैयार करना
- अपेक्षित सीमा को ढकने वाले 5 से 8 मानक लें, जिनमें एक ब्लैंक (शून्य) हो।
- उन्हें नमूनों वाले ही बफ़र में बनाएँ, ताकि बफ़र दोनों पर एक-सा असर डाले।
- एक ही स्टॉक को पतला करके बनाएँ, और नमूनों के साथ दो या तीन बार मापें।
रेखा फ़िट करना
सांद्रता के सामने रीडिंग प्लॉट करें और न्यूनतम वर्ग विधि से सीधी रेखा, रीडिंग = ढलान × सांद्रता + अंतःखंड, फ़िट करें। फिर हर नमूने के लिए:
सांद्रता = (रीडिंग − अंतःखंड) ÷ ढलान
अगर मापने से पहले नमूना पतला किया हो तो तनुकरण गुणांक से गुणा करें।
एक उदाहरण
0, 250, 500 और 1,000 µg/mL के BSA मानक 0.05, 0.37, 0.66 और 1.21 का अवशोषण देते हैं। फ़िट की गई रेखा लगभग रीडिंग = 0.00115 × सांद्रता + 0.068 है। 1:5 पतला किया नमूना 0.48 पढ़ता है: (0.48 − 0.068) ÷ 0.00115 = वेल में 358 µg/mL, यानी मूल नमूने में लगभग 1.8 mg/mL।
कर्व परखना
- R² लगभग 0.99 से ऊपर आम है। कम मान पिपेटिंग की गलती या अलग-थलग बिंदु की ओर इशारा करता है।
- मानकों के भीतर रहें। सबसे ऊँचे मानक से ऊपर की रीडिंग एक्सट्रपोलेशन है; नमूना पतला करके फिर मापें।
- मोड़ पर नज़र रखें। कई परीक्षण ऊँची सांद्रता पर सपाट हो जाते हैं। मुड़ने वाले ऊपरी मानक हटाएँ, या छोटी सीमा लें।
कैलकुलेटर
स्टैंडर्ड कर्व कैलकुलेटर रेखा फ़िट करता है, R² देता है और हर नमूने को उसके तनुकरण के साथ निकालता है। मानकों की योजना सीरियल डाइल्यूशन कैलकुलेटर से बनाएँ; शुद्ध प्रोटीन के लिए प्रोटीन सांद्रता कैलकुलेटर कर्व की जगह A280 इस्तेमाल करता है।