Fungsi kurva standar
Banyak uji, seperti Bradford, BCA, ELISA, dan qPCR, memberi pembacaan yang naik seiring konsentrasi, tetapi tidak dengan besaran tetap yang diketahui. Mengukur sekaligus sampel dengan konsentrasi yang diketahui, yaitu standar, menunjukkan hubungan pembacaan dan konsentrasi pada pengujian itu, dan sampel yang tidak diketahui dibaca dari hubungan tersebut.
Menyiapkan standar
- Pakai 5 sampai 8 standar yang mencakup rentang yang diperkirakan, termasuk blanko (nol).
- Buat dalam buffer yang sama dengan sampel, agar buffer memengaruhi keduanya sama rata.
- Buat dengan mengencerkan satu stok, lalu ukur duplo atau triplo bersama sampel.
Mencocokkan garis
Plot pembacaan terhadap konsentrasi dan cocokkan garis lurus, pembacaan = kemiringan × konsentrasi + intersep, dengan kuadrat terkecil. Lalu untuk tiap sampel:
konsentrasi = (pembacaan − intersep) ÷ kemiringan
Kalikan dengan faktor pengenceran jika sampel diencerkan sebelum diukur.
Contoh perhitungan
Standar BSA 0, 250, 500, dan 1.000 µg/mL memberi absorbansi 0,05, 0,37, 0,66, dan 1,21. Garis hasil pencocokan kira-kira pembacaan = 0,00115 × konsentrasi + 0,068. Sampel yang diencerkan 1:5 terbaca 0,48: (0,48 − 0,068) ÷ 0,00115 = 358 µg/mL di sumur, atau sekitar 1,8 mg/mL pada sampel asli.
Menilai kurva
- R² di atas sekitar 0,99 umum. Nilai lebih rendah menandakan kesalahan pemipetan atau pencilan.
- Tetap dalam rentang standar. Pembacaan di atas standar tertinggi adalah ekstrapolasi; encerkan sampel dan ukur lagi.
- Perhatikan lengkungan. Banyak uji mendatar pada konsentrasi tinggi. Buang standar teratas yang melengkung, atau pakai rentang yang lebih sempit.
Kalkulator
Kalkulator kurva standar mencocokkan garis, memberi R², dan menghitung setiap sampel beserta pengencerannya. Rencanakan standar dengan kalkulator pengenceran bertingkat; untuk protein murni, kalkulator konsentrasi protein memakai A280 sebagai ganti kurva.