Cara Menghitung Perubahan Lipat qPCR dengan ΔΔCt

Yang Anda perlukan

Nilai Ct gen target dan gen referensi (gen housekeeping seperti GAPDH atau ACTB yang ekspresinya tidak berubah karena perlakuan), diukur pada sampel perlakuan dan sampel kontrol.

Tiga langkah

1. Normalisasi tiap sampel dengan gen referensi: ΔCt = Ct target − Ct referensi.
2. Bandingkan perlakuan dengan kontrol: ΔΔCt = ΔCt perlakuan − ΔCt kontrol.
3. Ubah menjadi perubahan lipat: perubahan lipat = 2^−ΔΔCt.

Contoh perhitungan

Perlakuan: Ct target 22,1, Ct referensi 18,0, jadi ΔCt = 4,1. Kontrol: Ct target 24,5, Ct referensi 18,0, jadi ΔCt = 6,5.

ΔΔCt = 4,1 − 6,5 = −2,4, dan perubahan lipat = 2^2,4 = 5,3. Target diekspresikan sekitar 5,3 kali lebih banyak pada sampel perlakuan. Perubahan lipat di bawah 1 berarti ekspresi lebih rendah; 0,5 berarti setengahnya.

Saat 2^-ΔΔCt tidak cukup

Metode ini mengasumsikan kedua pasang primer memiliki efisiensi mendekati 100%, yaitu produk berlipat dua setiap siklus. Periksa dengan kurva standar; rentang yang umum adalah 90% sampai 110%. Jika efisiensinya berbeda, pakai metode Pfaffl, yang memasukkan efisiensi tiap gen: rasio = E_target^{ΔCt target} ÷ E_referensi^{ΔCt referensi}, dengan setiap ΔCt adalah kontrol dikurangi perlakuan dan E = 1 + efisiensi.

Ulangan dan statistik

• Rata-ratakan ulangan teknis (sumur dari sampel yang sama) sebelum menghitung ΔCt.
• Lakukan uji statistik pada nilai ΔCt atau ΔΔCt dari ulangan biologis, bukan pada perubahan lipat, karena perubahan lipat tidak terdistribusi normal.
• Laporkan log₂ perubahan lipat, yang sama dengan −ΔΔCt, jika ingin kenaikan dan penurunan berada pada skala yang sama.

Kalkulator

Kalkulator ΔΔCt merata-ratakan ulangan, memberi ΔCt, ΔΔCt, perubahan lipat, dan log₂-nya, serta beralih ke metode Pfaffl saat Anda mengisi efisiensi primer. Untuk kuantifikasi absolut dengan kurva standar, kalkulator jumlah salinan DNA menghitung salinan pada tiap standar.