ΔΔCt法でqPCRの発現変動を計算する方法

必要なもの

標的遺伝子と参照遺伝子（GAPDHやACTBなど、処理で発現が変わらないハウスキーピング遺伝子）のCt値を、処理群と対照群のサンプルで測定したものです。

3つのステップ

1. 参照遺伝子で各サンプルを補正：ΔCt = 標的のCt − 参照のCt
2. 処理群と対照群を比べる：ΔΔCt = 処理群のΔCt − 対照群のΔCt
3. 発現変動に変換：発現変動 = 2^−ΔΔCt

計算例

処理群：標的Ct 22.1、参照Ct 18.0なのでΔCt = 4.1。対照群：標的Ct 24.5、参照Ct 18.0なのでΔCt = 6.5。

ΔΔCt = 4.1 − 6.5 = −2.4で、発現変動 = 2^2.4 = 5.3です。処理群では標的が約5.3倍多く発現しています。1未満なら発現が少ないことを意味し、0.5は半分です。

2^-ΔΔCt法では足りないとき

この方法は、両方のプライマーの増幅効率がほぼ100%（1サイクルごとに産物が2倍）であることを前提にしています。検量線で確認し、90〜110%が通常の範囲です。効率が異なる場合は、各遺伝子の効率を計算に入れるPfaffl法を使います：比 = E_標的^{ΔCt 標的} ÷ E_参照^{ΔCt 参照}。ここで各ΔCtは対照 − 処理、E = 1 + 効率です。

反復と統計

• 技術的反復（同じサンプルの複数ウェル）は、ΔCtを出す前に平均します。
• 統計検定は、発現変動ではなく生物学的反復のΔCtやΔΔCtの値で行います。発現変動は正規分布にならないためです。
• 発現の増加と減少を同じ尺度で示したいときは、log₂発現変動（−ΔΔCtと同じ）を報告します。

計算ツール

ΔΔCt計算は、反復のCt値を平均し、ΔCt、ΔΔCt、発現変動、log₂発現変動を求めます。プライマー効率を入力するとPfaffl法に切り替わります。検量線による絶対定量では、DNAコピー数の計算で各スタンダードのコピー数を求められます。