血球計算盤で細胞を数える方法

数え方

1. 細胞をトリパンブルーと混ぜます。多くは1:1で、死細胞が青く染まります。
2. カバーガラスの下に約10 µLを入れます。
3. 四隅の大区画4つで、染まっていない細胞を数えます。上と左の線に触れている細胞は数え、下と右の線に触れている細胞は数えないことで、二重に数えるのを防ぎます。
4. 生存率が必要なら、青い細胞も別に数えます。

式

大区画は1 mm × 1 mmで深さ0.1 mm、つまり0.1 µL、10⁻⁴ mLです。したがって:

1 mLあたりの細胞数 = 1区画あたりの平均 × 希釈倍率 × 10⁴

数えた値が50、46、52、48なら平均は49です。トリパンブルーで1:1に希釈した(倍率2)なら、49 × 2 × 10⁴ = 9.8 × 10⁵個/mLです。

生存率は、生細胞の数を全細胞数で割って100を掛けた値です。

計算例

• 希釈なし：120、132、118、126 の平均は 124。細胞数/mL = 124 × 1 × 10⁴ = 1.24 × 10⁶ 細胞/mL。
• トリパンブルー 1:1、死細胞あり：生細胞の平均 62、死細胞の平均 8。生細胞数/mL = 62 × 2 × 10⁴ = 1.24 × 10⁶ 細胞/mL、生存率 = 62 ÷ (62 + 8) = 89%。
• 濃すぎるので先に 1:10 に希釈：1:10 に希釈し、さらにトリパンブルーと 1:1 で混ぜたあとの平均が 45（合計の希釈倍率 20）。細胞数/mL = 45 × 20 × 10⁴ = 9 × 10⁶ 細胞/mL（元の懸濁液）。
• 総細胞数と播種する量：1.24 × 10⁶ 細胞/mL が 10 mL なら 1.24 × 10⁷ 個。5 × 10⁵ 個を播くには 5 × 10⁵ ÷ 1.24 × 10⁶ = 0.40 mL を取ります。

希釈倍率を間違えないために

希釈倍率は、全体の体積を、そこに含まれる細胞懸濁液の体積で割った値です。細胞とトリパンブルーを等量なら 2、培地 900 µL に細胞 100 µL なら 10、両方なら 20 です。1 区画あたり約 20 個未満や約 200 個超の計数は精度が落ちるので、濃い懸濁液は希釈し、薄いものは区画を多く数えます。

倍加時間

2回の計数から求めます: 倍加時間 = 経過時間 × ln 2 ÷ ln(N₂ ÷ N₁)。48時間で1 × 10⁵個から8 × 10⁵個に増えた細胞は3回倍加しており、16時間ごとに倍になっています。

計算ツール

血球計算盤の計算は、1 mLあたりの細胞数、生存率、目的の細胞数をまくのに必要な量を示します。細胞倍加時間の計算は、倍加時間と増殖速度を求めます。