モル比で考える理由
ライゲーションの効率は質量ではなく、DNA末端の数で決まります。小さなインサートは大きなベクターよりng あたりの分子数がずっと多いので、同じ質量では分子数が大きく違ってしまいます。そのためプロトコールではインサートとベクターのモル比を指定し、最もよく使われるのは3:1です。
式
インサート(ng) = ベクター(ng) × インサートの長さ ÷ ベクターの長さ × 比
3,000 bpのベクター50 ngと1,000 bpのインサートを3:1で使うなら、50 × 1,000 ÷ 3,000 × 3 = 50 ngのインサートです。
コツ
- 最初にコロニーが少なければ、1:1、3:1、5:1を試します。
- アニールしたオリゴのような非常に短いインサートは、高い比が必要なことが多いです。
- 切れ残りや自己連結したベクターによるバックグラウンドを確かめるため、ベクターだけのライゲーションを対照に入れます。
- 濃度は精製前ではなく精製後に測ります。
計算ツール
ライゲーションの計算は、どんな比でもインサートのng数を示し、インサートの濃度を入れればピペットで取る量もわかります。その濃度はDNA 濃度の計算で求められます。
液量を含めた例
上の例では、ベクター50 ngとインサート50 ngが必要です。ベクターが50 ng/µL、インサートが25 ng/µLなら次のようになります。
- ベクター: 50 ÷ 50 = 1 µL
- インサート: 50 ÷ 25 = 2 µL
- 10×リガーゼバッファー: 2 µL、T4 DNAリガーゼ: 1 µL
- 水で20 µLに: 14 µL
モルで確かめる
二本鎖DNAの1塩基対は約650 g/molなので、pmol = ng × 1,000 ÷ (bp × 650) です。ベクターは 50,000 ÷ (3,000 × 650) ≈ 0.026 pmol、インサートは 50,000 ÷ (1,000 × 650) ≈ 0.077 pmolで、ちょうど3倍です。
コロニーが少ない、または出ない
- リガーゼバッファー中のATPは凍結融解を繰り返すと分解します。バッファーは少量ずつ分注して保存してください。
- 平滑末端は付着末端よりずっとつながりにくいので、リガーゼを増やし、反応時間を長くします。
- 脱リン酸化したベクターには、5′リン酸を持つインサートが必要です。通常のプライマーで作ったPCR産物にはありません。