モル比で考える理由
ライゲーションの効率は質量ではなく、DNA末端の数で決まります。小さなインサートは大きなベクターよりng あたりの分子数がずっと多いので、同じ質量では分子数が大きく違ってしまいます。そのためプロトコールではインサートとベクターのモル比を指定し、最もよく使われるのは3:1です。
式
インサート(ng) = ベクター(ng) × インサートの長さ ÷ ベクターの長さ × 比
3,000 bpのベクター50 ngと1,000 bpのインサートを3:1で使うなら、50 × 1,000 ÷ 3,000 × 3 = 50 ngのインサートです。
コツ
- 最初にコロニーが少なければ、1:1、3:1、5:1を試します。
- アニールしたオリゴのような非常に短いインサートは、高い比が必要なことが多いです。
- 切れ残りや自己連結したベクターによるバックグラウンドを確かめるため、ベクターだけのライゲーションを対照に入れます。
- 濃度は精製前ではなく精製後に測ります。
計算ツール
ライゲーションの計算は、どんな比でもインサートのng数を示し、インサートの濃度を入れればピペットで取る量もわかります。その濃度はDNA 濃度の計算で求められます。