播種密度は面積あたり
接着細胞はふつう、培養面積1 cm²あたりの細胞数で播種します。同じ密度ならどの容器でも同じ被覆率になるからです。主な培養面積は次のとおりです。
- 96ウェルプレート：1ウェルあたり0.32 cm²
- 24ウェルプレート：1ウェルあたり1.9 cm²
- 12ウェルプレート：1ウェルあたり3.8 cm²
- 6ウェルプレート：1ウェルあたり9.5 cm²
- T25、T75、T175フラスコ：25、75、175 cm²
面積はメーカーによって少し違うので、製品の仕様書を確認してください。
3つのステップ
- 容器あたりの細胞数 = 密度 × 面積。6ウェルプレートに20,000細胞/cm²なら、20,000 × 9.5 = 1ウェルあたり190,000細胞。
- 必要な総細胞数 = 容器あたりの細胞数 × 容器の数に、ピペット操作のロス分として約10%を足します。6ウェルなら190,000 × 6 × 1.1 = 1,254,000細胞。
- 懸濁液の量 = 総細胞数 ÷ 計数した細胞濃度（細胞/mL）。血球計算盤で1,000,000細胞/mLなら1.25 mLで、必要な全量（6 × 2 mL = 12 mLに10%を足した量）まで培地でメスアップします。
密度の決め方
密度は細胞株と、細胞を使いたい時期によって決まります。決まった日に目標のコンフルエンスにしたいなら、倍加時間から逆算します。継代のダメージから回復した後（ふつう約1日後）は、倍加時間ごとに1回細胞数が倍になります。24時間で倍加する株を25%の被覆率でまけば、2〜3日でほぼコンフルエントになります。多くの細胞株については、販売元の資料や論文のプロトコルに初期密度の目安が載っています。
均一にまくコツ
細胞は1〜2分で沈むので、分注の直前ごとに懸濁液を混ぜます。播種後は円を描くように揺らすと細胞がウェルの縁に寄るので、前後・左右の十字に動かし、15〜30分置いて細胞を落ち着かせてからインキュベーターに入れます。
ツール
血球計算盤の計算で細胞を数え、その値と密度を細胞播種の計算に入れると、プレートやフラスコに必要な懸濁液と培地の量がわかります。細胞倍加時間の計算では、2回の計数から倍加時間を求められます。