Die Aussaatdichte gilt pro Fläche
Adhärente Zellen werden meist mit einer Dichte in Zellen pro cm² Wachstumsfläche ausgesät, damit dieselbe Dichte in jedem Gefäß dieselbe Bedeckung ergibt. Übliche Flächen:
- 96-Well-Platte: 0,32 cm² pro Well
- 24-Well-Platte: 1,9 cm² pro Well
- 12-Well-Platte: 3,8 cm² pro Well
- 6-Well-Platte: 9,5 cm² pro Well
- T25-, T75- und T175-Flaschen: 25, 75 und 175 cm²
Prüfe das Datenblatt des Herstellers; die Flächen weichen je nach Marke etwas ab.
Drei Schritte
- Zellen pro Gefäß = Dichte × Fläche. Bei 20.000 Zellen/cm² in einer 6-Well-Platte: 20.000 × 9,5 = 190.000 Zellen pro Well.
- Zellen insgesamt = Zellen pro Gefäß × Anzahl Gefäße, plus etwa 10 % Pipettierverlust. Sechs Wells: 190.000 × 6 × 1,1 = 1.254.000 Zellen.
- Volumen Suspension = Zellen insgesamt ÷ deine Zählung in Zellen/mL. Bei 1.000.000 Zellen/mL aus der Neubauer-Kammer: 1,25 mL, mit Medium auf das nötige Gesamtvolumen aufgefüllt (6 × 2 mL = 12 mL, plus 10 %).
Die Dichte wählen
Die Dichte hängt von der Zelllinie ab und davon, wann du die Zellen brauchst. Um an einem bestimmten Tag eine Ziel-Konfluenz zu erreichen, rechne mit der Verdopplungszeit rückwärts: Nach der Erholung vom Passagieren, meist nach etwa einem Tag, verdoppeln sich die Zellen einmal pro Verdopplungszeit. Eine Linie, die sich alle 24 Stunden verdoppelt und mit 25 % Bedeckung ausgesät wird, ist nach zwei bis drei Tagen fast konfluent. Datenblätter der Anbieter und veröffentlichte Protokolle nennen für die meisten Linien eine Startdichte.
Gleichmäßig aussäen
Misch die Suspension direkt vor jedem Transfer, denn die Zellen setzen sich innerhalb von ein, zwei Minuten ab. Beweg die Platten nach dem Aussäen kreuzförmig (vor-zurück, links-rechts) statt im Kreis, was die Zellen an den Rand drückt, und lass sie 15 bis 30 Minuten absetzen, bevor sie in den Brutschrank kommen.
Werkzeuge
Zähl die Zellen mit dem Hämozytometer-Rechner und gib Zählung und Dichte in den Zellaussaat-Rechner ein, um die Volumen von Suspension und Medium für Platten und Flaschen zu erhalten. Der Verdopplungszeit-Rechner berechnet die Verdopplungszeit aus zwei Zählungen.