Warum ein Mastermix
Jede Komponente in jedes Gefäß zu pipettieren ist langsam und fügt jedes Mal einen kleinen Fehler hinzu. Ein Mastermix vereint alles, was die Reaktionen gemeinsam haben, in einem Gefäß und wird vor dem Template auf die Gefäße verteilt. Jede Reaktion bekommt denselben Mix, und du pipettierst viel weniger kleine Volumina.
Übliche Endkonzentrationen
- Puffer: 1× (aus einer 10×- oder 5×-Stammlösung).
- dNTPs: je 0,2 mM.
- MgCl2: 1,5 bis 2,5 mM, falls der Puffer es nicht schon enthält.
- Primer: je 0,1 bis 0,5 µM.
- Taq-Polymerase: etwa 1,25 Units pro 50-µL-Reaktion.
- Template: 1 pg bis 100 ng, je nach Herkunft.
Folge dem Handbuch deiner Polymerase, wo es abweicht; besonders High-Fidelity-Enzyme haben eigene Empfehlungen.
Die Volumina berechnen
Für jede Komponente gilt Volumen pro Reaktion = Endkonzentration ÷ Stammkonzentration × Reaktionsvolumen. In einer 25-µL-Reaktion braucht 10×-Puffer 2,5 µL, und 10-µM-Primer auf 0,5 µM brauchen je 1,25 µL. Wasser füllt den Rest nach dem Template auf.
Multipliziere jedes Volumen mit der Zahl der Reaktionen plus etwa 10 %, weil etwas in Spitzen und an Gefäßwänden verloren geht. Für 10 Reaktionen setzt du 11 an.
Zusammenstellen
- Taue die Komponenten auf Eis auf, vortexe sie und zentrifugiere kurz (außer der Polymerase).
- Gib zuerst Wasser vor, dann Puffer, dNTPs, MgCl2 und Primer.
- Gib die Polymerase zuletzt dazu, mische sanft durch Pipettieren oder Schnippen und zentrifugiere kurz.
- Verteile den Mix auf die Gefäße und gib jeweils das Template dazu. Nimm eine Kontrolle ohne Template mit Wasser mit.
Rechner
Der PCR-Mastermix-Rechner berechnet jedes Volumen für beliebig viele Reaktionen. Prüfe die Annealing-Temperatur deiner Primer mit dem Primer-Tm-Rechner und setze Primer-Stammlösungen mit dem Oligo-Resuspensionsrechner an.