PCR 마스터 믹스 만드는 방법

마스터 믹스를 쓰는 이유

모든 성분을 튜브마다 피펫팅하면 시간이 오래 걸리고 그때마다 작은 오차가 생깁니다. 마스터 믹스는 반응에 공통된 것을 한 튜브에 모아, 주형을 넣기 전에 튜브로 나눕니다. 모든 반응이 같은 믹스를 받고, 소량 피펫팅도 훨씬 줄어듭니다.

흔한 최종 농도

• 버퍼: 1×(10× 또는 5× 스톡에서).
• dNTP: 각 0.2 mM.
• MgCl₂: 버퍼에 들어 있지 않다면 1.5~2.5 mM.
• 프라이머: 각 0.1~0.5 µM.
• Taq 중합효소: 50 µL 반응당 약 1.25 유닛.
• 주형: 출처에 따라 1 pg~100 ng.

중합효소 설명서와 다르면 설명서를 따르세요. 특히 고정확도 효소는 자체 권장 사항이 있습니다.

부피 계산

각 성분에 대해 반응당 부피 = 최종 농도 ÷ 스톡 농도 × 반응 부피입니다. 25 µL 반응에서 10× 버퍼는 2.5 µL, 10 µM 프라이머를 0.5 µM로 쓰려면 각각 1.25 µL입니다. 주형을 뺀 나머지는 물로 채웁니다.

팁과 튜브 벽에 액체가 남으므로 모든 부피에 반응 수와 약 10% 여유분을 곱합니다. 10반응이면 11반응분을 만듭니다.

섞는 순서

1. 성분을 얼음 위에서 녹이고 볼텍스한 뒤 잠깐 원심분리합니다(중합효소 제외).
2. 물을 먼저 넣고, 이어서 버퍼, dNTP, MgCl₂, 프라이머를 넣습니다.
3. 중합효소를 마지막에 넣고 피펫팅이나 가볍게 튕겨 섞은 뒤 원심분리합니다.
4. 믹스를 튜브에 나누고 각각 주형을 넣습니다. 주형 대신 물을 넣은 음성 대조군도 만듭니다.

계산기

PCR 마스터 믹스 계산기는 반응 수에 맞춰 모든 부피를 계산합니다. 프라이머의 어닐링 온도는 프라이머 Tm 계산기로 확인하고, 프라이머 스톡은 올리고 용해 계산기로 만드세요.