Por qué usar una mezcla maestra
Pipetear cada componente en cada tubo es lento y añade un pequeño error cada vez. Una mezcla maestra reúne en un tubo todo lo que comparten las reacciones, que luego se reparte entre los tubos antes de añadir el molde. Todas las reacciones reciben la misma mezcla y pipeteas muchos menos volúmenes pequeños.
Concentraciones finales habituales
- Tampón: 1× (a partir de un stock 10× o 5×).
- dNTP: 0,2 mM de cada uno.
- MgCl2: de 1,5 a 2,5 mM, si el tampón no lo lleva ya.
- Cebadores: de 0,1 a 0,5 µM cada uno.
- Taq polimerasa: unas 1,25 unidades por reacción de 50 µL.
- Molde: de 1 pg a 100 ng, según su origen.
Sigue el manual de tu polimerasa cuando sea distinto; las enzimas de alta fidelidad tienen sus propias recomendaciones.
Calcular los volúmenes
Para cada componente, volumen por reacción = concentración final ÷ concentración del stock × volumen de reacción. En una reacción de 25 µL, el tampón 10× necesita 2,5 µL y cada cebador de 10 µM a 0,5 µM, 1,25 µL. El agua completa el volumen después del molde.
Multiplica cada volumen por el número de reacciones más un 10% aproximadamente, porque algo de líquido se pierde en las puntas y las paredes. Para 10 reacciones, prepara para 11.
Montar la mezcla
- Descongela los componentes en hielo, agítalos y centrifúgalos brevemente (menos la polimerasa).
- Añade primero el agua y después el tampón, los dNTP, el MgCl2 y los cebadores.
- Añade la polimerasa al final, mezcla con suavidad pipeteando o golpeando el tubo y centrifuga.
- Reparte la mezcla en los tubos y añade a cada uno su molde. Incluye un control sin molde con agua.
Calculadoras
La calculadora de mezcla maestra de PCR calcula todos los volúmenes para cualquier número de reacciones. Comprueba la temperatura de hibridación de tus cebadores con la calculadora de Tm de cebadores y prepara sus stocks con la calculadora de resuspensión de oligos.