El recuento
- Mezcla las células con azul tripán, a menudo 1:1, que tiñe de azul las células muertas.
- Carga unos 10 µL bajo el cubreobjetos.
- Cuenta las células sin teñir en los cuatro cuadrados grandes de las esquinas. Cuenta las que tocan las líneas de arriba y de la izquierda pero no las de abajo y de la derecha, para no contar ninguna dos veces.
- Cuenta aparte las células azules si quieres la viabilidad.
La fórmula
Cada cuadrado grande mide 1 mm × 1 mm y 0,1 mm de profundidad, es decir 0,1 µL, o 10−4 mL. Por tanto:
células por mL = media por cuadrado × factor de dilución × 104
Recuentos de 50, 46, 52 y 48 dan una media de 49. Con una dilución 1:1 en azul tripán (factor 2): 49 × 2 × 104 = 9,8 × 105 células/mL.
La viabilidad es el número de células vivas dividido entre el total, por 100.
Ejemplos resueltos
- Sin dilución: recuentos de 120, 132, 118 y 126 dan una media de 124. Células por mL = 124 × 1 × 104 = 1,24 × 106 células/mL.
- Azul de tripano 1:1, con células muertas: la media de vivas es 62 y la de muertas 8. Células vivas por mL = 62 × 2 × 104 = 1,24 × 106 células/mL; viabilidad = 62 ÷ (62 + 8) = 89 %.
- Demasiado densa, diluida 1:10 antes: la media es 45 tras diluir 1:10 y mezclar 1:1 con azul de tripano (factor total 20). Células por mL = 45 × 20 × 104 = 9 × 106 células/mL en la suspensión original.
- Células totales y volumen a sembrar: 1,24 × 106 células/mL en 10 mL son 1,24 × 107 células. Para sembrar 5 × 105 células, toma 5 × 105 ÷ 1,24 × 106 = 0,40 mL.
Acertar con el factor de dilución
El factor de dilución es el volumen total dividido entre el volumen de suspensión celular que contiene. Partes iguales de células y azul de tripano es 2; 100 µL de células en 900 µL de medio es 10; hacer las dos cosas es 20. Contar menos de unas 20 o más de unas 200 células por cuadrado da estimaciones malas, así que diluye las suspensiones densas y cuenta más cuadrados en las poco densas.
Tiempo de duplicación
A partir de dos recuentos: tiempo de duplicación = tiempo × ln 2 ÷ ln(N2 ÷ N1). Unas células que pasan de 1 × 105 a 8 × 105 en 48 horas se han duplicado tres veces, una cada 16 horas.
Calculadoras
La Calculadora de hemocitómetro da las células por mL, la viabilidad y el volumen que sembrar para un número de células concreto. La Calculadora de tiempo de duplicación celular calcula el tiempo de duplicación y la tasa de crecimiento.