Cómo reconstituir una proteína o un péptido liofilizado

La fórmula

volumen a añadir = masa en el vial ÷ concentración objetivo

Mantén las unidades a juego: mg ÷ mg/mL da mL, y µg ÷ µg/µL da µL.

Ejemplos

• 5 mg de péptido a 2 mg/mL: 5 ÷ 2 = 2,5 mL.
• 100 µg de anticuerpo a 0,5 mg/mL (0,5 µg/µL): 100 ÷ 0,5 = 200 µL.
• 1 mg de un péptido de 1.500 g/mol a 1 mM: 0,001 g ÷ 1.500 g/mol = 0,667 µmol, y 0,667 µmol ÷ 1 mmol/L = 667 µL.

Comprueba cuánto hay de verdad en el vial

El polvo de un péptido sintético no es todo péptido. Los contraiones como el trifluoroacetato y el agua ligada suelen ser del 10 % al 30 % del peso, así que el certificado de análisis puede indicar un contenido neto de péptido de, por ejemplo, el 80 %. Multiplica la masa bruta por esa fracción antes de calcular: 5 mg al 80 % son 4 mg de péptido. En las proteínas, revisa la cantidad en la ficha técnica y, tras disolver, confirma la concentración por la absorbancia a 280 nm.

Elegir el disolvente

• Sigue primero la ficha técnica. La mayoría de las proteínas y anticuerpos vuelven a agua o al tampón del que se liofilizaron.
• Los péptidos con muchos residuos básicos (K, R, H) se disuelven mejor en un poco de ácido acético diluido; los ácidos (D, E), en un poco de bicarbonato de amonio diluido.
• Los péptidos muy hidrofóbicos pueden necesitar primero un volumen pequeño de DMSO y luego una dilución lenta en tampón. Evita el DMSO con péptidos que tengan cisteína o metionina, que puede oxidar.

Pasos

1. Deja que el vial llegue a temperatura ambiente antes de abrirlo, para que no se condense humedad sobre el polvo.
2. Centrifúgalo un momento para que todo el polvo quede en el fondo.
3. Añade el disolvente despacio por la pared del vial.
4. Agita suavemente o hazlo rodar y déjalo de 15 a 30 minutos. No pases las proteínas por el vórtex con fuerza: pueden desnaturalizarse y hacer espuma.
5. Si sigue turbio, un baño de ultrasonidos breve puede ayudar con los péptidos. Las partículas que queden no están disueltas: centrifúgalas y mide la concentración del sobrenadante.

Guardarlo

Reparte la solución en alícuotas de un solo uso y congélalas a −20 °C o −80 °C, porque cada ciclo de congelación y descongelación puede costar actividad. Las proteínas diluidas por debajo de unos 0,1 mg/mL se pegan a las paredes del tubo; una proteína portadora como BSA al 0,1 % lo evita cuando no interfiere con el experimento.

Calculadoras

La Calculadora de reconstitución da el volumen para una concentración objetivo, o la concentración a partir de un volumen, en unidades de masa o molares. Comprueba el resultado con la Calculadora de concentración de proteínas (A280) y planifica las diluciones de trabajo con la Calculadora de soluciones stock.